孫 婕，尹國友，丁蒙蒙，陶戰(zhàn)霞（河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山467036）

韭菜籽蛋白的提取及抗氧化活性研究初探

孫 婕，尹國友，丁蒙蒙，陶戰(zhàn)霞
（河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山467036）

以脫脂韭菜籽粉為原料，采用磷酸鹽緩沖液法制備韭菜籽蛋白。以韭菜籽蛋白的提取率、DPPH·清除率及羥基自由基（·OH）清除率為指標，對提取溫度、提取時間、pH及料液比四個因素各取三個水平，進行L9（34）正交實驗，確定最優(yōu)的制備工藝。最優(yōu)的工藝條件如下：提取溫度48℃，提取時間1.5h，pH7.5，料液比1∶10。在此條件下進行驗證實驗，測得韭菜籽蛋白的提取率為9.87%，在韭菜籽蛋白濃度分別為1mg/mL和2mg/mL時，對·OH和DPPH·清除率分別為73.37%和25.2%，說明采用磷酸鹽緩沖溶液法制備得到的韭菜籽蛋白具有抗氧化活性。

韭菜籽蛋白，提取，抗氧化活性

韭菜籽是韭菜的干燥成熟的種子，在藥典中，我們又稱其為“韭籽”。韭菜籽是傳統(tǒng)中藥必不可少的組分之一。關于其特性功效及應用等的記載，最早出現(xiàn)在《名醫(yī)別錄》中[1]。韭菜籽具有“溫補肝腎，壯陽固精”之功效，韭籽作為壯陽補腎用入藥在我國民間已有數(shù)千年的歷史[2-5]。

目前尚未見有關韭菜籽蛋白質、韭菜籽多肽的研究報道。本實驗以韭菜籽中的蛋白提取率為考察指標，采用單因素和正交實驗法確定韭菜籽蛋白的提取條件，并通過清除1，1-二苯基-2-三硝基甲苯苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine， DPPH·）和羥基自由基（hydroxyl free radical，·OH）能力來初步評價其抗氧化活性，為植物種子蛋白的有效提取及植物資源的充分利用提供科學依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂韭菜籽粉（蛋白含量31.48%） 平頂山市農(nóng)業(yè)科學院提供；二苯代苦味肼基自由基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH·） Sigma公司；丁基羥基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、水楊酸、雙氧水、十二水合硫酸亞鐵、水楊酸等 上海索萊寶生物科技有限公司，分析純。

FA1004B型電子天平、PHSJ-3F型pH計 上海精密科學儀器有限公司；紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HWS28型恒溫水浴鍋 上海-恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 韭菜籽蛋白制備流程 脫脂韭菜籽粉→緩沖液提取→離心、過濾取上清→飽和硫酸銨鹽析→離心→沉淀→透析→冷凍干燥→韭菜籽蛋白。

1.2.2 蛋白質標準曲線的制作 分別取0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL的濃度為1mg/mL牛血清白蛋白標準溶液于試管中，再加蒸餾水補充至0.10mL，然后取5mL已配制好的考馬斯亮藍試劑于試管中，搖勻，并在5min后測其595nm下的光吸收值，并做標準曲線。

1.2.3 緩沖液提取韭菜籽蛋白單因素實驗 緩沖液對韭菜籽蛋白的提取效果主要受到溫度、提取時間、緩沖液的pH及料液比的影響[7-11]。需要通過實驗明確各個因素對提取效果的影響程度。

1.2.3.1 提取時間對提取率的影響 稱取1g脫脂韭菜籽粉，加入10mL 0.02mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液，在48℃下攪拌提取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00h，離心并過濾取其上清液，計算韭菜籽蛋白提取率。

1.2.3.2 提取溫度對提取率的影響 稱取1g脫脂韭菜籽粉，加入10mL pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液，分別在4、28、48、76、90℃下攪拌提取2h，離心并過濾取其上清液，計算韭菜籽蛋白提取率。

1.2.3.3 料液比對提取率的影響 稱取1g脫脂的韭菜籽粉，分別加入5、7.5、10、12.5、15mL 0.02mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液，即料液比分別為1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15（g/mL），在48℃下攪拌提取2h，離心并過濾取其上清液，計算韭菜籽蛋白提取率。

1.2.3.4 提取pH對提取率的影響 稱取1g脫脂韭菜籽粉，選用pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液10mL作為提取溶液，在48℃下攪拌2h，離心并過濾取其上清液，計算韭菜籽蛋白提取率。

1.2.4 正交實驗設計 進行單因素實驗后，以提取率為指標?？疾焯崛r間、提取溫度、料液比和提取溶液pH對實驗結果的影響，其實驗因素與水平設計見表1。以提取率為考察指標，從而篩選出最佳的提取工藝。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 L9（34）factors and levels of orthogonal test

1.2.5 提取率的測定 計算公式如下所示：

1.2.6 鹽析、透析冷凍干燥 向蛋白液中緩慢加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，靜置3h。然后在4000r/min條件下離心15min，棄去上清液。沉淀物用0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖溶液溶解，裝入透析袋，透析，48h。冷凍干燥，得韭菜籽蛋白粉。

1.2.7 抗氧化指標檢測

1.2.7.1 對DPPH·清除效果測定 參考任海偉等的方法[12]，取樣品液2mL及2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液加入具塞試管中，搖勻，暗處反應30min，在517nm比色，測定其吸光度Ai；再測量DPPH·溶液與無水乙醇1∶1混合的吸光度Ac；2mL樣品液與2mL無水乙醇的吸光度Aj。

抑制率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

式中：Ac為DPPH+無水乙醇；Ai為樣品液+DPPH；Aj為樣品液+無水乙醇。

將BHT和得到的韭菜籽蛋白分別配制成濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL溶液，分別測定DPPH·清除率。

1.2.7.2 對·OH清除效果測定 參考郭倩等的方法[13]，反應體系中加9mmol/L FeSO42mL，9mmol/L水楊酸-乙醇2mL，樣品3mL，最后加8.8mmol/L H2O22mL，啟動反應，37℃反應1h，以蒸餾水為參比，在510nm下測量樣品的吸光值Ax；反應體系中加9mmol/L FeSO42mL，9mmol/L水楊酸-乙醇2mL，3mL蒸餾水和2mL的8.8mmol/L H2O2，以蒸餾水為參比在510nm下測量空白對照的吸光值A0；反應體系中加9mmol/L FeSO42mL，9mmol/L水楊酸-乙醇2mL，樣品3mL和2mL蒸餾水，以蒸餾水為參比在510nm下測量吸光值Ax0。

清除率（%）=[A0-（Ax-Ax0）/A0]×100

式中，A0為空白對照液的吸光度；Ax為加入待測溶液后的吸光度；Ax0為不加顯色劑H2O2的待測溶液吸光度。

將BHT和得到的韭菜籽蛋白分別配制成濃度為0.05、0.1、1.5、1.0、1.5、2.0mg/mL溶液，分別測定·OH清除率。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖均采用Execl 2003軟件，所有實驗重復5次。

2 結果與分析

2.1 考馬斯亮藍法測蛋白含量標準曲線

考馬斯亮藍法測蛋白含量得到的蛋白質標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質含量標準曲線Fig.1 The standard curve of protein content

通過做標準曲線，得到直線方程y=0.0022x-0.001，相關系數(shù)R2=0.9966。根據(jù)此標準曲線測定韭菜籽蛋白含量。

2.2 韭菜籽蛋白提取條件的確定

2.2.1 提取時間對韭菜籽蛋白提取率的影響 由圖2可以看出，隨著提取時間的延長，韭菜籽蛋白提取率先增加后減少，在2h左右時達到最大值，之后韭菜籽蛋白提取率開始有所下降，原因是提取時間過長，導致部分蛋白質變性，由圖2分析可知，提取時間為2h時，韭菜籽蛋白提取率最大。

圖2 提取時間對韭菜籽蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of extraction time on protein extraction of leek seed

2.2.2 提取溫度對韭菜籽蛋白提取率的影響 由圖3可以看出，隨著提取溫度的升高，韭菜籽蛋白提取率先增加后減少，由于溫度過高過低都會影響蛋白質的生物活性，因此，由圖3看出，最適提取溫度為48℃時，韭菜籽蛋白提取率最大。

圖3 提取溫度對韭菜籽蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on protein extraction of leek seed

2.2.3 料液比對韭菜籽蛋白提取率的影響 由圖4可以看出，隨著緩沖液加入量的增加，韭菜籽蛋白的提取率逐漸增加，但超過1∶10后，提取率成下降的趨勢，因此料液比1∶10左右較為合適。

圖4 料液比對韭菜籽蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of extraction solid-liquid ratio on protein extraction of leek seed

2.2.4 提取溶液pH對韭菜籽蛋白提取率的影響 由圖5可以看出，隨著提取溶液pH的增加，韭菜籽蛋白提取率先增加后減少，在pH=7.5時達到最大值，故提取pH為7.5時，韭菜籽蛋白提取率最大。

圖5 提取溶液pH對韭菜籽蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of extraction pH on protein extraction of leek seed

2.3 韭菜籽蛋白提取條件優(yōu)化

四因素三水平正交表實驗結果如表2所示。

表2 L9（34）正交實驗結果Table 2 Results of L9（34）orthogonal test

由表2可知，韭菜籽蛋白的最佳提取工藝條件為A1B2C1D2。但由于料液比1∶7.5在實驗過程中易造成較大誤差，再考慮到原料經(jīng)濟成本問題，因此確定料液比為1∶10，即最佳工藝是提取溫度為48℃，提取時間為1.5h，提取pH為7.5，料液比為1∶10。由極差分析可知，因素主次關系為D＞C＞B＞A，即pH為主要因素，其次為料液比、提取溫度和提取時間。由表2可知，F(xiàn)A= 0.166＜F0.05（2，4）=6.94，F(xiàn)B=1.834＜F0.05（2，4）=6.94，認為因素A和B對實驗結果無顯著影響，而FC=26.777＞F0.01（2，4）=18，F(xiàn)D=55.580＞F0.01（2，4）=18，認為因素C和D對實驗結果有極顯著影響。在最佳條件A1B2C2D2（即在1.5h，溫度48℃，料液比為1∶10，pH為7.5條件下）進行驗證實驗，測得韭菜籽蛋白提取率為9.87%。

表3 正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal combination experiment

2.4 韭菜籽蛋白的抗氧化活性測定

2.4.1 韭菜籽蛋白和BHT對DPPH·的清除效果 從圖6可以看出，以BHT為對照，隨著韭菜籽蛋白濃度的提高，清除率逐漸增大。當濃度為2mg/mL時，清除率達25.2%。由于DPPH·體系中乙醇是溶劑，因此BHT溶解度較高，當BHT濃度為2mg/mL時，清除率可達93.68%。由此可知，在乙醇體系中，BHT對DPPH·的清除效果優(yōu)于韭菜籽蛋白。

圖6 韭菜籽蛋白和BHT對DPPH·清除效果比較Fig.6 The removal rate of DPPH·between leek seed protein and BHT

2.4.2 韭菜籽蛋白和BHT對·OH的清除效果 由圖7可以看出，韭菜籽蛋白對·OH有較好的清除能力。在濃度為0.1～1mg/mL時，其對·OH的清除率高于BHT。在濃度為1mg/mL時，清除率可達73.37%。

3 結論

隨著生命科學的迅速發(fā)展，人們對蛋白質等生物分子的研究興趣及應用日益增強，現(xiàn)在已提取出的多種功能性蛋白可用于醫(yī)用和保健。本實驗采用磷酸緩沖液提取，鹽析的方法以獲得韭菜籽蛋白。重點研究了影響磷酸緩沖液提取的因素，采用四因素三水平正交實驗法確定了磷酸緩沖液提取韭菜籽蛋白的最佳工藝，在提取溫度48℃，提取時間1.5h，pH7.5和料液比1∶10的條件下，韭菜籽蛋白的提取率為9.87%，并對·OH和DPPH·有一定的清除效果，初步確定采用磷酸鹽緩沖溶液提取得到的韭菜籽蛋白具有抗氧化活性。這為推動韭菜籽資源的充分利用，開發(fā)新型具有抗氧化作用的產(chǎn)品提供了實驗基礎。

圖7 韭菜籽蛋白和BHT對·OH清除效果比較Fig.7 The removal rate of·OH between leek seed protein and BHT

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Study on extraction and antioxidant activity of protein from Chinese chive seed

SUN Jie，YIN Guo-you，DING Meng-meng，TAO Zhan-xia
（College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，China）

The preparation and antioxidant activity of protein from defatted Chinese chive seed powder by phosphate buffer extraction method were studied.With the leek seed protein extraction ratio，DPPH radical scavenging rate and·OH radical scavenging rate ability as index，it explored the effect of extraction temperature，extraction time，pH and solid-liquid ratio for each three levels on polypeptide material extraction of leek seed and maked L9（34）orthogonal test to determine the optimal preparation conditions.The optimal technological conditions were as follows：extraction temperature 48℃，extraction time 1.5h，pH7.5 and the ratio of solid-liquid 1∶10 and the largest amount of extracted protein could reach 9.87%.When the leek seed protein concentration were 1mg/mL and 2mg/mL，the OH·and DPPH·removal rate were 73.37%and 25.2%respectively.The protein from defatted Chinese chive seed with the phosphate buffer solution had antioxidant activity.

leek seed protein；extraction；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2014）12-0291-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.055

2013－09－10

孫婕（1976-），女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及功能性質研究。

河南省科技計劃重點科技攻關項目（132102210192）；河南省教育廳科學技術重點研究項目（14A550003）；平頂山市農(nóng)業(yè)科學院合作項目（20121220）。