孫雪萍，徐 艷，楊家林（廣西海洋研究所海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣西北海536000）

祖師麻多糖提取工藝及體外抗氧化活性的研究

孫雪萍，徐 艷，楊家林
（廣西海洋研究所海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣西北海536000）

目的：優(yōu)選祖師麻多糖的最佳提取工藝，對其單糖組成進行分析，并對其體外抗氧化活性進行研究。方法：采用正交實驗法，以多糖得率為指標(biāo)，對祖師麻多糖的提取工藝進行優(yōu)選。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法對其單糖組成進行分析。采用比色法，測定了祖師麻多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力，還原能力以及總體抗氧化能力。結(jié)果：祖師麻多糖的最佳提取工藝為15倍量水，100℃提取3次，每次2h；單糖組成分析表明祖師麻多糖主要含有甘露糖，氨基葡萄糖，葡萄糖，半乳糖和巖藻糖；祖師麻多糖顯示出較強的DPPH自由基清除能力，還原能力和總體抗氧化能力，以及中等強度的羥基自由基清除能力。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠，祖師麻多糖具有較強的抗氧化活性。

祖師麻多糖，提取工藝，正交實驗，單糖組成，抗氧化

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香Daphne giraldii Nitsche.陜甘瑞香Daphne tangutica Maxim.或Daphne retusa Hemsl.的干燥莖皮和根皮，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)之功效，臨床多用于風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，祖師麻具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、中樞神經(jīng)抑制、抑菌等藥理活性[1-2]。化學(xué)成分研究表明，祖師麻主要含有香豆素類、二萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、蒽醌類及甾醇類等化學(xué)成分[3-4]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對祖師麻的研究主要集中在其脂溶性成分，而對其多糖的研究較少，有關(guān)祖師麻多糖的結(jié)構(gòu)研究更是未見報道。本研究采用正交實驗法，確定祖師麻多糖的最佳提取工藝，并在此基礎(chǔ)上，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法對其多糖的單糖組成進行分析，并對其體外抗氧化活性進行了研究，以期為祖師麻多糖的分離純化及藥理活性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

祖師麻藥材 購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定為瑞香科植物Daphne giraldii Nitsche.的干燥根皮；DPPH（二苯代苦味?；HT（二丁基羥基甲苯）、甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品 購自Sigma-Aldrich（Sigma公司，美國）；色譜純乙腈 購自Fisher Scientific（Fisher公司，美國）；其余試劑 均為分析純。

RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FA1004N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260 Infinity HPLC安捷倫高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 祖師麻多糖的提取工藝 稱取10.0g干燥的祖師麻藥材（含水量為9.3%），粉碎過10目篩，用10倍量95%乙醇浸泡靜置24h，加熱回流提取2次，每次30min，抽濾，棄去上清液，取沉淀將乙醇揮干。將回流后的總沉淀收集，按照正交實驗設(shè)定的參數(shù)加入一定量蒸餾水（料液比），在設(shè)定的不同溫度（提取溫度）下加熱提取一定時間（提取次數(shù)、提取時間），過濾，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65℃減壓濃縮至原體積的1/4，加入4倍量的無水乙醇醇沉，充分?jǐn)嚢韬?℃放置24h，抽濾，沉淀依次用無水乙醇，丙酮清洗，60℃真空干燥得到祖師麻多糖（DGP）。

1.2.2 祖師麻多糖得率的測定 采用重量法測定祖師麻多糖的得率，將1.2.1中真空干燥的DGP置于分析電子天平稱重，按照下式計算祖師麻多糖得率。

多糖得率（%）=多糖質(zhì)量（g）/祖師麻藥材質(zhì)量（g）×100

1.2.3 提取工藝的優(yōu)選 分別取祖師麻藥材10.0g，根據(jù)文獻研究和前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇料液比（A祖師麻藥材與水的質(zhì)量比），提取時間（B，h），提取次數(shù)（C），提取溫度（D，℃）為考察因素，選用L9（34）正交實驗進行提取工藝的優(yōu)選[5]。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Design for factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 總糖、硫酸基、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量的測定 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定祖師麻粗多糖的總糖含量[6]，采用硫酸鋇-明膠比濁法，以經(jīng)過五氧化二磷干燥的硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品測定硫酸基含量[6]，采用硫酸咔唑法，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品測定糖醛酸含量[6]，采用Folin酚法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)含量[6]。

1.2.5 單糖組成分析

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZOBAX-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH6.7）/CH3CN（83∶17，V/V）；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10μL；檢測器：DAD（245nm）。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品衍生條件 取10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖）各1mg，加入100μL 0.3mol/L NaOH溶液，120μL 0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）溶液，70℃衍生1h，氯仿萃取后采用高效液相色譜分析[7]。

1.2.5.3 樣品單糖組成測定 取祖師麻多糖3mg，用2mol/L三氟乙酸在110℃進行全水解6h，反復(fù)加甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸至無酸味，與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下衍生，進樣10μL，高效液相色譜分析，記錄色譜圖。與各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間對照，確定樣品單糖組成。

1.2.6 體外抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取4mg DPPH，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，DPPH濃度為0.004%，避光保存（0～4℃）。取樣品液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL（不足體積用相應(yīng)的空白溶劑補齊至1.0mL）與4mL 0.004%DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30min，以相應(yīng)空白溶劑為空白在517nm測定其吸光度A，計算其清除率，陽性對照為BHT[8]。

清除率（%）=[（A0－A1）/A0]×100

式中：A0—1mL空白溶劑加4.0mL DPPH溶液的

吸光度，A1—待測液加4.0mL DPPH溶液的吸光度。1.2.6.2 羥基自由基清除能力的測定 利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥基自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)。該物質(zhì)在510nm下具有最大吸收。反應(yīng)體系中含有8.8mmol/L的H2O21mL，9mmol/L的FeSO41mL，9mmol/L的水楊酸-乙醇各1mL，不同濃度的樣品溶液1mL，最后加入H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)30min，以超純水為參比，在510nm下測量各濃度的吸光度?？紤]到樣品本身的吸光值，以9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L的水楊酸-乙醇1mL、不同濃度的樣品溶液1mL和蒸餾水1mL作為樣品的本底吸收值。按照下試計算其清除率（%），陽性對照為BHT[9]。

清除率（%）=[A0－（Ax－Ax0）]/A0×100

式中：A0—空白對照液的吸光度，Ax—加入樣品溶液的吸光度，Ax0—不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.2.6.3 還原能力的測定 在試管分別加入不同濃度的被測溶液1.0mL。磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L pH=6.6）2.5mL和1%鐵氰化鉀2.5mL，置于50℃電熱恒溫水浴鍋中反應(yīng)20min，然后加入10%的三氯乙酸2.5mL，搖勻，離心。吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液，測定樣品在700nm處測定吸光值，陽性對照為BHT[10]。

1.2.6.4 總體抗氧化能力的測定 0.1mL的提取物與1mL的試劑溶液P溶液（含有0.6mol/L硫酸，28mmol/L磷酸鈉，4mmol/L鉬酸銨）混合，95℃反應(yīng)90min，待試管冷卻到室溫后，695nm下比色，以抗壞血酸比較[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗結(jié)果分析

表2 正交實驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance of orthogonal experiment

以多糖得率為指標(biāo)，按照L9（34）正交實驗進行實驗，結(jié)果見表2。

根據(jù)正交實驗直觀分析和方差分析結(jié)果可知（表2和表3），4個因素極差值R大小順序為A＞C＞D＞B，對祖師麻多糖提取得率的影響因素依次為料液比＞提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時間，其中料液比與提取次數(shù)對祖師麻多糖得率具有顯著性影響。根據(jù)直觀分析結(jié)果，祖師麻多糖的最優(yōu)提取工藝為A2B3C3D3，即加15倍量水，100℃攪拌提取3次，每次2h。根據(jù)優(yōu)選的最佳工藝，進行驗證實驗，祖師麻多糖的得率為3.87%±0.27%。

2.2 單糖組成分析

復(fù)方水相中總糖含量為62.25%，蛋白含量為5.51%，糖醛酸含量為15.18%，未檢測到硫酸根。單糖組成分析結(jié)果表明祖師麻多糖主要含有甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖（圖1）。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DGP對DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，其溶液具有特征的紫紅色團吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光法進行定量分析，目前以分光光度法測定加入不同濃度的抗氧化劑或待測樣品后吸光度的分析方法是一種篩選自由基清除劑的常用方法[12]。由圖2可知，隨著濃度的不斷增加，DGP對DPPH·的清除率逐漸上升，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)DGP濃度為0.4mg/mL時，其對DPPH·自由基的清除率達到21.44%高于同濃度下BHT的15.4%。當(dāng)DGP濃度為2mg/mL時，其清除率為57.78%，低于同濃度下BHT的76.98%，但是總體來看，DGP（IC50=1.22mg/mL）與BHT（IC50=0.97mg/mL）的DPPH自由基清除能力相差不大，因此DGP具有顯著的DPPH自由基清除作用。

圖1 祖師麻多糖單糖組成分析Fig.1 HPLC analysis of monosaccharide composition in DGP

圖2 DGP對DPPH自由基的清除能力（±s，n=3）Fig.2 Scavenging effect of DGP on DPPH free radicals（±s，n=3）

2.3.2 DGP對羥基自由基的清除作用 羥基自由基是一類化學(xué)性質(zhì)非常活潑的自由基，可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，尤其是對脂質(zhì)過氧化的作用最強。因此羥基自由基清除作用被認為是抗氧化活性的重要指標(biāo)[13]。由圖3可知，在0～2.0mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著DGP濃度的增加，清除羥基自由基的作用逐漸增強，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，但是與BHT相比清除作用仍然比較弱。雖然在清除羥基自由基能力上低于BHT，但是在一定的測試范圍內(nèi)，DGP仍然表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

圖3 DGP對羥基自由基的清除能力（±s，n=3）Fig.3 Scavenging effect of DGP on hydroxyl free radicals（±s，n=3）

2.3.3 DGP的還原能力 樣品的還原能力與抗氧化活性有明顯相關(guān)性?？寡趸瘎┩ㄟ^自身的還原作用給出電子從而清除自由基。還原能力越強，抗氧化性越強。通常采用鐵氰化鉀氧化樣品來表征還原力，體系中Fe3+，在抗氧化劑的促進下變成Fe2+，形成的Fe2+在700nm處有吸收。最終檢測吸光值越大，還原力越強。因此，一種物質(zhì)的還原力可作為考察潛在其抗氧化能力的重要指標(biāo)[13]。由圖4可知，DGP的還原能力隨著濃度的增加而增大，但量效關(guān)系表現(xiàn)一般。在0～0.8mg/mL的濃度范圍內(nèi)，祖師麻多糖的還原能力要強于BHT。在濃度為1.0mg/mL時，吸光度達到0.501。

圖4 DGP的還原能力（±s，n=3）Fig.4 Reducing power of DGP（±s，n=3）

2.3.4 總體抗氧化活性 總體抗氧化活性常用于定量換算抗氧化劑的能力。由圖5可知，以抗壞血酸作為對照，DGP的總體抗氧化能力相當(dāng)于抗壞血酸的50%。上述四個實驗結(jié)果表明祖師麻多糖具有較強的體外抗氧化活性。

圖5 DGP的總體抗氧化能力（±s，n=3）Fig.5 Total antioxidant activity of DGP（±s，n=3）

近年來我國對植物多糖的研究日益廣泛，已有報道表明很多植物多糖具有抗癌、抗衰老等功能，而這些功能主要又與多糖的抗氧化作用有關(guān)，因此植物多糖的抗氧化作用可以用于多種生物活性的初步評價。本研究結(jié)果表明DGP具有顯著的DPPH自由基清除能力，一定的羥基自由基清除能力，較強的還原能力和總體抗氧化能力。結(jié)合前期的藥效學(xué)研究結(jié)果，提示祖師麻多糖作為抗氧化功能因子在保健食品與臨床應(yīng)用中具有較大的前瞻性，應(yīng)用前景樂觀。臨床研究表明氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和發(fā)展，在這一過程中活性氧自由基一方面破壞病原菌和病變細胞，另一方面又進攻白細胞造成其大量死亡，結(jié)果引起溶酶體酶的大量釋放而進一步殺傷或殺死組織細胞，造成骨、軟骨的破壞而導(dǎo)致炎癥和關(guān)節(jié)炎。祖師麻作為一種治療疼痛、跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和支氣管炎的常用植物藥，其多糖的抗氧化作用很可能是其抗炎作用的有效作用途徑之一。

3 結(jié)論

本研究通過正交實驗優(yōu)選祖師麻多糖的提取工藝，最佳提取工藝為15倍量水，100℃提取3次，每次2h；單糖組成分析結(jié)果表明祖師麻多糖主要含有甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖；抗氧化研究表明，祖師麻多糖具有顯著的DPPH自由基清除能力，其IC50為1.22mg/mL與BHT相差不大；祖師麻多糖具有一定強度的羥基自由基清除能力，但是與BHT相比有一定差距；祖師麻多糖也顯示出較強的還原能力，其總體抗氧化能力約為抗壞血酸的50%。本研究為祖師麻多糖的后期開發(fā)提供了理論依據(jù)，同時其結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系方面的研究有待于進一步開展。

[1]李書慧，吳立軍，殷紅英.祖師麻化學(xué)和藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2002，27（6）：401-403.

[2]張薇，蘇娟，扈曉佳，等.中藥祖師麻的三種基源植物的化學(xué)及藥理活性[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（3）：233-238.

[3]周光雄，楊永春，石建功.祖師麻活性化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2006，31（7）：555-557.

[4]盛華剛，朱立俏，王遠國，等.大孔樹脂純化祖師麻中香豆素類成分的工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（23）：14-17.

[5]王莉，姚全勝.毛蚶多糖提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：215-217.

[6]劉新，孔雯，邵長倫，等.中藥復(fù)方海藻制劑水煎液水相化學(xué)組成分析[J].中國海洋藥物，2010，29（2）：27-30.

[7]付海寧，趙峽，于廣利，等.鹽藻多糖單糖組成分析的四種色譜方法比較[J].中國海洋藥物，2008，27（4）：30-34.

[8]王倩倩，馬驥，?？》?，等.莢果蕨中多糖的超聲輔助處理提取及其DPPH自由基清除作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（15）：220-223.

[9]Liu X，Sun Z L，Zhang M S，et al.Antioxidant and antihyperlipidemic activities of polysaccharides from sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Carbohydrate Polymers， 2012，90（4）：1664-1670.

[10]劉新，夏雪奎，袁文鵬，等.女貞子體外抗氧化活性研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，34（4）：364-365.

[11]劉新，楊海，夏雪奎，等.黃藥子體外抗氧化活性研究[J].中藥材，2010，33（10）：1612-1614.

[12]聶少平，謝明勇，羅珍.用清除有機自由基DPPH法評價茶葉多糖的抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2006，27（3）：34-36.

[13]趙玉紅，金秀明，韓睿.鹿茸多糖分離純化及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（12）：155-158.

[14]劉薇，王紅霞，王立魁，等.COX-2/Nr2/ARE信號通絡(luò)與體內(nèi)外的抗炎、抗氧化作用機理[J].生命科學(xué)，2011，23（10）：1027-1033.

Study on the extraction process of crude polysaccharide from Daphne giraldii and its antioxidant activity in vitro

SUN Xue-ping，XU Yan，YANG Jia-lin
（Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

Objective：To optimize the extraction process of crude polysaccharide from Daphne giraldii Nitsche（DGP）and analyze its monosaccharide composition，and investigate its antioxidant activity in vitro.Methods：Using the polysaccharide yield as the index，orthogonal design experiment was employed to optimize the extraction process.1-phenyl-3-methy-5-pyrazolone precolumn derivatization high performance liquid chromatography（PMP-HPLC）method was used to analyze the monosaccharide composition.Antioxidant properties of DGP were evaluated by different antioxidant tests，including DPPH free radical scavenging activity，hydroxyl radical scavenging activity，reducing power and assay of total antioxidant activity in different chemical simulated systems with colorimetry method.Results：The optimum extraction process was added 15 times amount of water for 3 times，and 2 hours for each time at 100℃.Monosaccharide composition analysis indicated that DGP was mainly composed of mannose，glucosamine，glucose，galactose and fucose.DGP possessed potential DPPH free radical scavenging activity，and moderate hydroxyl free radical scavenging activity.It also exhibited some functions of reducing power and total antioxidant.Conclusion：The optimum extraction process was stable.DGP could be applied to as a potential natural antioxidant.

polysaccharide from Daphne giraldii Nitsche；extraction process；orthogonal test；monosaccharide composition；antioxidant

TS201.2

B

1002-0306（2014）12-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.050

2013－09－23

孫雪萍（1982-），女，博士，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科攻11107011-8）；廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費資助項目（13YJ22HYS15）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（桂科攻11107011-6）。