王澤鋒，石 玲，蘇一蘭，閔 勇（紅河學(xué)院理學(xué)院，云南蒙自661199）

響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯蕷粗多糖乙醇沉淀工藝

王澤鋒，石 玲，蘇一蘭，閔 勇*
（紅河學(xué)院理學(xué)院，云南蒙自661199）

優(yōu)化了紫薯蕷中粗多糖的乙醇沉淀工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間、醇沉溫度、相對(duì)密度為自變量，粗多糖得率為響應(yīng)值，采用中心組合（Box-Behnken）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)粗多糖得率的影響，采用Design-Expert軟件，建立了粗多糖得率與乙醇沉淀過(guò)程中各因素的二次多項(xiàng)式模型，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法確定了紫薯蕷粗多糖乙醇沉淀最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、醇沉?xí)r間18h、醇沉溫度0.5℃、相對(duì)密度1.23。該條件下粗多糖得率驗(yàn)證值為2.49%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.32%。

紫薯蕷，粗多糖，響應(yīng)曲面法，苯酚-硫酸法，紫外可見(jiàn)分光光度法

多糖（polysaccharides，PS），又稱(chēng)多聚糖，是一種具有廣泛生物活性的大分子，自然界中廣泛存在于有機(jī)物體中的生物聚合體。多糖不僅是各種生物的營(yíng)養(yǎng)成分，而且還參與多種生命活動(dòng)。大多數(shù)的多糖都屬于中藥中所指五味藥中的甘味藥，此類(lèi)藥是人體代謝所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，強(qiáng)壯機(jī)體，增強(qiáng)、調(diào)節(jié)免疫功能，提高抗病能力[1-4]等作用。因此，活性多糖提取及功效研究已經(jīng)成為生物醫(yī)藥研究的重要內(nèi)容之一。紫薯蕷別名紫山藥、紫蒔藥，是薯蕷科草本蔓生性植物，紫薯蕷塊根表皮紫褐色，肉乳白色中帶紫點(diǎn)或?yàn)槿仙斜绕胀ㄊ硎毟嗟木S生素和微量元素，特別是多糖、花色苷、皂苷、氨基酸，具滋肺、益腎、健脾、止瀉、降壓、利肝等功效，是集美味和保健于一體的藥食兼用的綠色食品[5-6]。目前，在我國(guó)，對(duì)紫薯蕷主要活性多糖成分提取的方法主要是常規(guī)水提法[7]、超聲波輔助提取法[8]、纖維素酶法[9]。目前，乙醇沉淀法已應(yīng)用于特色生物資源中多糖的提取，而對(duì)于采用乙醇沉淀法提取紫薯蕷中的多糖尚未見(jiàn)報(bào)道。

多糖是多羥基的醛或酮，可溶于水，但是多糖水溶液中加入乙醇會(huì)破壞其中的氫鍵，從而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。利用多糖溶于水而不溶于高濃度的乙醇，可使多糖從水溶液中沉淀出來(lái)。乙醇沉淀法提取生物資源中的多糖具有設(shè)備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、便于規(guī)?；a(chǎn)，具有較好的適用性[10-11]的優(yōu)點(diǎn)。本論文以紫薯蕷為原料，研究了乙醇沉淀法提取多糖的條件，考察了乙醇的體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間、醇沉溫度和相對(duì)密度對(duì)粗多糖得率的影響，并采用響應(yīng)法對(duì)多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.2.2 紫薯蕷中多糖的提取 紫薯蕷中粗多糖的提取采用以下方法進(jìn)行[15]：稱(chēng)取5.0g紫薯蕷樣品，勻漿，置于微波萃取儀專(zhuān)用三頸燒瓶中，以水作為溶劑，料液比1∶30（g∶mL）、提取溫度90℃、提取時(shí)間1h，微波功率為900W，微波頻率是2450MHz，于微波萃取儀加熱，用玻砂漏斗過(guò)濾得到紫薯蕷提取液，收集備用。1.2.3 乙醇沉淀法從紫薯蕷提取液中提取多糖 取紫薯蕷提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（40～45℃時(shí)測(cè)定，韋氏比重稱(chēng)法）；加乙醇并攪拌；靜置；采用4000r/min離心分離10min，棄去上清液，收集得到的粗多糖。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 紫薯蕷中粗多糖提取單因素實(shí)驗(yàn) 以粗多糖得率為指標(biāo)，分別考察紫薯蕷水提液濃縮至相對(duì)密度（1.00、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%、95%）、醇沉?xí)r間（12、14、16、18、20、22h）、醇沉溫度（0、5、10、15、20、25℃）對(duì)粗多糖得率的影響，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、醇沉

1.1 材料與儀器

紫薯蕷 于2012年11月采自云南省紅河州元陽(yáng)縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，挑選當(dāng)年采收，新鮮無(wú)腐爛的塊狀“糊蘆”根莖，將紫山藥洗凈備用；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%無(wú)水乙醇等 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

MAS-Ⅱ型常溫微波萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；UV-2000X型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼科有限公司；FA1004型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量與得率的測(cè)定

1.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱(chēng)取105℃下干燥至恒重的葡萄糖10mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分別置于10mL容量瓶中，然后加入1mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，搖勻后放置20min。加入蒸餾水定容。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為自變量，吸光度為因變量，獲得葡萄糖濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線[12]。

1.2.1.2 多糖的測(cè)定 粗多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[13-14]。精密吸取樣品溶液1mL于10mL容量瓶中，并加水稀釋定容。然后精密量取1mL于10mL容量瓶中，加入1mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，混勻后靜置20min，加入蒸餾水定容。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定紫薯蕷粗多糖含量：多糖類(lèi)在硫酸作用下，先水解成單糖分子，迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚合成有色化合物，以比色法測(cè)定其含量[10]。粗多糖得率計(jì)算公式如下：時(shí)間18h、醇沉溫度5℃。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Design-Expert軟件中的BBD響應(yīng)面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-17]，選取沉淀用相對(duì)密度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、醇沉?xí)r間（C）和醇沉溫度（D）四個(gè)對(duì)多糖微波提取效果影響顯著的因素為自變量，每個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。以粗多糖得率（Y）為響應(yīng)值，對(duì)紫薯蕷中粗多糖的乙醇沉淀方法進(jìn)行四因素三水平研究，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。具體的實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。

表1 BBD響應(yīng)面因素水平表Table 1 Process variables and their levels in four variables-three levels of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將上述已處理的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在490nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值，按1.2.1.1中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。A=30.105+ 0.0182c，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for glucose concentration determination

2.2 紫薯蕷多糖提取的工藝選擇

2.2.1 相對(duì)密度對(duì)粗多糖得率的影響 由圖2可知，相對(duì)密度在1.00～1.20內(nèi)，隨著相對(duì)密度的增加，提取得粗多糖得率明顯上升，當(dāng)達(dá)到1.20時(shí)，粗多糖得率最高，再增加提取液相對(duì)密度，粗多糖得率反而下降，這可能是因?yàn)樾D(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮過(guò)程中，加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分紫薯蕷多糖降解為單糖[18-19]，乙醇沉淀出的多糖含量減少。因此，選擇1.2作為最佳的醇沉提取相對(duì)密度。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響 采用醇沉法提取多糖時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響很大，主要取決于多糖的相對(duì)分子質(zhì)量的大小和分子的形狀。一般情況下，多糖的分子質(zhì)量越大，被沉淀下來(lái)所需的乙醇體積分?jǐn)?shù)越小[10]。粗多糖得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%升高到80%，粗多糖得率明顯增加。但進(jìn)一步增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，粗多糖得率變化不明顯，這主要是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，部分多糖溶于乙醇溶液而未被沉淀下來(lái)，導(dǎo)致粗多糖得率下降。因此，綜合考慮乙醇用量及粗多糖得率，沉淀用乙醇體積分?jǐn)?shù)取80%。

圖2 相對(duì)密度對(duì)粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of relative density on the yield of crude polysaccharides

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of alcohol concentration on the yield of crude polysaccharides

2.2.3 醇沉?xí)r間對(duì)粗多糖得率的影響 由圖4可知，醇沉?xí)r間在12～18h內(nèi)，隨著醇沉?xí)r間的增加，粗多糖得率上升的幅度顯著。但是，醇沉?xí)r間在18～22h內(nèi)提取得到的粗多糖得率基本不變。這是由于紫薯蕷多糖在水溶液中溶解和擴(kuò)散達(dá)到了平衡而使粗多糖得率變化趨緩。綜合考慮，選擇18h作為最佳醇沉?xí)r間。

圖4 醇沉?xí)r間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of precipitation time on the yield of crude polysaccharides

2.2.4 醇沉溫度對(duì)粗多糖得率的影響 由圖5可知，醇沉溫度在0～25℃內(nèi)，隨著醇沉溫度的增加，粗多糖得率呈逐漸下降的趨勢(shì)，醇沉溫度在0℃時(shí)粗多糖得率含量達(dá)到最高，這是因?yàn)闇囟容^低時(shí)，降低多糖在醇沉溶液中的溶解度，有利于多糖的沉淀析出，溫度升高時(shí)，增加了多糖在醇沉溶液中的溶解度，導(dǎo)致沉淀析出的粗多糖含量較少，因此，選0℃作為最佳的醇沉溫度。

圖5 醇沉溫度對(duì)粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of precipitation temperature on the yield of crude polysaccharides

2.2.5 BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本次實(shí)驗(yàn)共有29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，分為兩類(lèi)：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有24個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，以多糖含量為響應(yīng)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.6 建立模型方程與方差分析 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到相對(duì)密度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、醇沉?xí)r間（C）、醇沉溫度（D）與粗多糖得率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=2.39+0.21A+0.13B+0.042C-0.095D-0.053AB-0.012AC-0.019AD+0.022BC-0.023BD+0.060CD-0.46A2-0.15B2-0.13C2-0.035D2

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。2.2.7 響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取條件的確定 由表3可知，該回歸模型極顯著（p＜0.0001），且方程的失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1322＞0.05），表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好，實(shí)驗(yàn)誤差小。模型決定系數(shù)R2=0.9559，說(shuō)明響應(yīng)值（得率）的變化有95.59%來(lái)源于所選變量，即相對(duì)密度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間和醇沉溫度。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件?；貧w方程中各自變量對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率p的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表中可以看出，各因素一次項(xiàng)A、B、D是極顯著的，二次項(xiàng)A2、B2、C2也是極顯著的，由此可見(jiàn)，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)紫薯蕷粗多糖得率的影響次序?yàn)椋合鄬?duì)密度一次項(xiàng)（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)一次項(xiàng)（B）＞醇沉溫度一次項(xiàng)（D）＞醇沉?xí)r間一次項(xiàng)（C）。

表2 乙醇沉淀粗多糖BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis for optimizing ethanol precipitation of crude polysaccharides

通過(guò)軟件分析，得到紫薯蕷粗多糖提取的最佳條件為：相對(duì)密度1.23、乙醇體積分?jǐn)?shù)73.37%、醇沉?xí)r間17.55h、醇沉溫度0.48℃，在此條件下，紫薯蕷粗多糖得率預(yù)測(cè)值為2.48%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件提取紫薯蕷粗多糖，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取參數(shù)修正為：相對(duì)密度1.23、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、醇沉?xí)r間18h、醇沉溫度0.5℃，在此修正條件下提取得到的紫薯蕷粗多糖的得率為2.49%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.32%小于l%。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取方法參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

應(yīng)用醇沉法提取紫薯蕷粗多糖，大大增加了紫薯蕷粗多糖得率。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝，從而求得紫薯蕷粗多糖乙醇沉淀法提取的最佳工藝條件是：醇沉用乙醇體積分?jǐn)?shù)是75%，相對(duì)密度為1.23，醇沉?xí)r間為18h，醇沉溫度0.5℃，紫薯蕷粗多糖得率為2.49%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the quadratic polynomial model

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Optimization on response surface models for the optimal extracting conditions of polysaccharides from purple yam via ethanol precipitation

WANG Ze-feng，SHI Ling，SU Yi-lan，MIN Yong*
（Department of Chemistry，Honghe University，Mengzi 661199，China）

Response surface methodology was used to optimize the ethanol precipitation technology of polysaccharides from purple yam.Based on single-factor experiments，ethanol concentration，precipitation time，precipitation temperature and relative density were selected as influencing factors during extraction.The experiment mathematical model was arranged according to Box-Behnken central composite experiment design，which studied each variable and their interactions on the yield of polysaccharide.The quadratic multinomial model on the contents of polysaccharide and each influence factor of ethanol precipitation of polysaccharides was established by using the Design-Expert software.The optimal conditions for precipitating polysaccharides obtained were achieved after 18h precipitation with 75%ethanol and relative density 1.23 at 0.5℃，under which the highest yield of polysaccharides reached with verified value being of 2.49%and the relative error was 0.32%compared to the predictive value.

purple yam；polysaccharide；response surface method；phenol-sulfuric acid method；UV-visible spectrophotometry

TS201.1

B

1002-0306（2014）12-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.044

2013－08－30 *通訊聯(lián)系人

王澤鋒（1984-），男，碩士研究生，助教，研究方向：天然產(chǎn)物與食品開(kāi)發(fā)。

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目2013FZ120。