張建國，錢會芳，陳曉明（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

白色鏈霉菌發(fā)酵ε-Polylysine動力學(xué)研究

張建國，錢會芳，陳曉明
（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

利用白色鏈霉菌（Streptomyces Albus KD-11）為出發(fā)菌株在30L全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行ε-PL分批發(fā)酵動力學(xué)研究?；贚ogistic方程、Luedeking-Piret方程、類似Luedeking-Piret方程建立了Streptomyces Albus KD-11菌體生長、ε-PL產(chǎn)物合成和底物葡萄糖消耗的動力學(xué)模型。利用Origin 8.1軟件對模型參數(shù)進(jìn)行非線性擬合，建立的模型擬合程度R2均大于0.980，擬合良好。當(dāng)葡萄糖初始濃度在45～55g/L范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測值平均相對誤差小于8%，適用性良好。表明該動力學(xué)模型對指導(dǎo)ε-PL的發(fā)酵工藝優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

白色鏈霉菌，分批發(fā)酵，動力學(xué)，ε-聚賴氨酸

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是L-賴氨酸同型聚合物，由L-賴氨酸間ε-酰胺連接而成的[1]。ε-PL酸性條件下高溫加熱后仍具有廣譜抑菌活性及體內(nèi)降解產(chǎn)物對人體有益無害[2-3]，于是2003年美國FDA允許其作為食品添加劑，其后ε-PL在食品防腐領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4-5]。目前，日本建立了ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)線，我國還處于實(shí)驗(yàn)室階段[6]。因此，研究ε-聚賴氨酸發(fā)酵動力學(xué)對指導(dǎo)生產(chǎn)技術(shù)具有重要經(jīng)濟(jì)意義。

發(fā)酵動力學(xué)模型的研究可將微觀現(xiàn)象和宏觀現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)，可以用來發(fā)現(xiàn)未知變量的重要性，尋找被忽略或未發(fā)現(xiàn)的重要影響參數(shù)[7]。白色鏈霉菌屬是目前ε-PL進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵的主要種屬，由于缺乏對其胞內(nèi)代謝調(diào)控的微觀認(rèn)識，其發(fā)酵過程控制還處于半經(jīng)驗(yàn)狀態(tài)。因此，發(fā)現(xiàn)和確定重要影響因素對其宏觀控制有著直接的指導(dǎo)意義，并對微觀研究提供線索。

發(fā)酵動力學(xué)模型具有一定的專一性，不同的菌株不同的發(fā)酵條件即使生產(chǎn)相同的產(chǎn)物其模型都是不同的。本研究適當(dāng)調(diào)整白色鏈霉菌KD-11合成ε-PL的最優(yōu)配方[8]，在30L發(fā)酵罐上研究ε-PL生產(chǎn)動力學(xué)過程，為進(jìn)一步工藝優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11） 本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

BIOTECH-30BSG型30L全自動發(fā)酵罐 上海寶興生物設(shè)備有限公司；萬分之一天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司；7200分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（g·L-1） 葡萄糖10，酵母浸膏1，蛋白陳2，瓊脂15，pH7.0～7.2，1×105Pa滅菌25min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（g·L-1） 葡萄糖10，酵母粉4，蛋白胨1，pH6.8，1×105Pa滅菌30min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1） 葡萄糖50，K2HPO41.500，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.03，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，KH2PO41.00，（NH4）2SO48.572，酵母粉5.00，pH6.8，1×105Pa滅菌30min，酵母粉與（NH4）2SO4單獨(dú)滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

1.3.1.1 種子培養(yǎng) 將活化的斜面白色鏈霉菌單孢子菌落接種至含有100mL種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，200r·min-1，30℃，搖床振蕩培養(yǎng)48h左右。

1.3.1.2 分批發(fā)酵 將5%接種量的種子培養(yǎng)液無菌接入含有20L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L-全自動發(fā)酵罐中，30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r·min-1，通氣量為0.8（VVM），培養(yǎng)72h，發(fā)酵過程記錄pH、溶氧（DO）變化。

1.3.2 ε-PL濃度測定-Itzhaki法[9]取發(fā)酵液離心所得的上清稀釋液2mL與2mL 1mmol·L-1甲基橙水溶液，在試管中混合后，30℃下振蕩反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后，8000r·min-1離心10min，取離心上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)于465nm處測OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線算出ε-聚賴氨酸的含量。

1.3.3 菌體濃度測定方法-干重法 取5～20mL發(fā)酵液6000r·min-1離心10min，棄上清液，再加去離子水懸浮、離心2次，獲沉淀放入干燥潔凈已知重量的培養(yǎng)皿中，80℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重，稱重，計(jì)算，得知菌體干重濃度（Dry cell weigh，DCW）。

1.3.4 殘?zhí)菨舛龋≧esidual glucose，RG）測定-采用DNS法[10]取離心后上清液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，采用3，5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中還原糖濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵過程參數(shù)非線性擬合和檢驗(yàn)采用Origin 8.1軟件分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL分批發(fā)酵過程特征

圖1為白色鏈霉菌分批發(fā)酵ε-PL過程曲線，顯示了菌體濃度（DCW）、殘?zhí)菨舛龋≧G）、ε-PL產(chǎn)物濃度、溶解氧濃度（DO）以及pH隨時(shí)間t的變化趨勢。從圖1可知，菌體經(jīng)過8h左右的延遲期進(jìn)入對數(shù)生長期，葡萄糖消耗加快、溶解氧濃度迅速下降處于20%以下達(dá)到40h，pH逐步下降。48h時(shí)菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度增長幅度銳減，達(dá)到6.8231g·L-1時(shí)不再增加，pH下降幅度加快，下降至3.21，與此同時(shí)ε-PL合成速度加快，發(fā)酵終了ε-PL濃度達(dá)到ε-PL 1.82g·L-1、殘?zhí)菨舛葹?4.89g·L-1。根據(jù)產(chǎn)物ε-PL形成與菌體生長的關(guān)系可以判斷產(chǎn)物ε-PL形成與菌體生長呈部分生長關(guān)聯(lián)型。發(fā)酵過程中隨菌體增值速度和濃度增加，需氧量增大，造成溶解氧降低，與此同時(shí)由于殘?zhí)菨舛容^高不能充分氧化分解形成酸類小分子物質(zhì)致使pH降低，同時(shí)培養(yǎng)基中生理酸性鹽（NH4）2SO4的利用也是pH降低的原因；從發(fā)酵過程中pH變化趨勢可看出在3.6～4.4之間ε-PL分泌速度最快與Kahar P等發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL時(shí)，在pH4左右大量積累而pH在5～8時(shí)ε-PL積累很少[12]相吻合。

圖1 白色鏈霉菌產(chǎn)ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵過程Fig.1 Profile of ε-PL batch fermentation by Streptomyces Albus KD-11

2.2 ε-PL分批發(fā)酵動力學(xué)模型與檢驗(yàn)

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型 通過圖1可以看出菌體的生長曲線呈S型，故利用Verhulst-Pearl提出的邏輯方程（Logistic equations），模擬白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11）的發(fā)酵過程。定義比生長速率μ如下：

式中，μmax為最大比生長速率（h-1），Cx為細(xì)胞濃度（g·L-1），Cx，max為最大細(xì)胞濃度（g·L-1）。

則菌體生長動力學(xué)方程為：

式中，t為發(fā)酵時(shí)間（h），對式（2）進(jìn)行積分得，

式中，Cx，0為初始時(shí)細(xì)胞濃度（g·L-1），將圖1數(shù)據(jù)代入式（3）進(jìn)行非線性擬合獲得生長動力參數(shù)Cx，0，Cx，max，μmax值分別為0.242、0.680、0.149，代入式（3）獲得菌體生長動力學(xué)方程。

由Logistic方程獲得的式（4）預(yù)測的模型值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比驗(yàn)證，結(jié)果見圖2。

圖2 白色鏈霉菌生長模型值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.2 Comparison of kinetic model with DCW date for Streptomyces Albus KD-11

從圖2可以看出，菌體生長模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值之間能夠較好的吻合，經(jīng)檢驗(yàn)其相關(guān)系數(shù)為R2=0.996。Logistic方程常用來構(gòu)建菌體對自身生長有抑制作用的菌體生長模型，常用于分批發(fā)酵過程[12-13]，表明該菌體的生長受到自身的影響。

2.2.2 ε-PL生成動力學(xué)模型 Gaden根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長的關(guān)系將產(chǎn)物的合成分為3類：a.產(chǎn)物生產(chǎn)與菌體生長相耦聯(lián)，b.產(chǎn)物生產(chǎn)與菌體生長部分耦聯(lián)，c.產(chǎn)物的形成與菌體的生長沒有關(guān)系[7]。圖1可以看出ε-PL的產(chǎn)物發(fā)酵與菌體生長部分耦聯(lián)，故采用Luedeking-Piret方程描述胞ε-poly-lys的生成速率為：

式中，Cp為ε-PL（g·L-1），α為與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物生成常數(shù)（g產(chǎn)物·（g細(xì)胞）-1），β為與菌體濃度相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物生成常數(shù)（g產(chǎn)物·（g細(xì)胞·h）-1），將式（2）和式（3）代入式（5），進(jìn)行積分可得式（6）。

將菌體生長動力參數(shù)Cx，0，Cx，max，μmax分別代入式（6）利用圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得到產(chǎn)物形成動力學(xué)參數(shù)α、β值分別為0.28011、0.000217，代入式（6）獲得產(chǎn)物濃度與時(shí)間的關(guān)系式，見式（7）。

由Luedeking-Piret方程獲得的式（7）預(yù)測模型值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。

圖3 ε-PL生成模型值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.3 Comparison of kinetic model with ε-PL production date for Streptomyces Albus KD-11

從圖3可以看出，ε-PL生成模型值和實(shí)驗(yàn)值之間能夠較好的吻合，經(jīng)檢驗(yàn)其相關(guān)系數(shù)為R2=0.980。

2.2.3 底物消耗動力學(xué)模型 ε-PL分批發(fā)酵過程中，底物碳源，一部分用于細(xì)胞生長，一部分合成產(chǎn)物，一部分用于能量消耗以維持細(xì)胞生命之用[7]。ε-PL的合成與菌體生長關(guān)系從圖1初步判斷為部分生長關(guān)聯(lián)型，擬用Luedeking-Piret相似的方程式來表示基質(zhì)消耗。

式中，Cs為葡萄糖濃度（g·L-1），α為與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物生成常數(shù)（g產(chǎn)物·（g細(xì)胞）-1），β為與菌體濃度相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物生成常數(shù)（g產(chǎn)物·（g細(xì)胞·h）-1），YG為用于菌體生長的碳源得率系數(shù)（g細(xì)胞·（g葡萄糖）-1），Yp/s為產(chǎn)物對底物的得率系數(shù)（g葡萄糖·（gε-PL）-1），m為菌體維持系數(shù)（[g葡萄糖·（g細(xì)胞·h）-1），發(fā)酵過程中碳源主要用于菌體生長和維持活性，用于產(chǎn)物形成的消耗的葡萄糖部分可以忽略不計(jì)，式（8）可簡化如下。

對式（9）進(jìn)行積分得到：

將菌體生長動力參數(shù)Cx，0，Cx，max，μmax分別代入式（10）利用圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得到產(chǎn)物形成動力學(xué)參數(shù)m、YG值分別為0.04771、0.35039代入式（10）得產(chǎn)物濃度與時(shí)間的關(guān)系式，如式（11）所示。

對上述建立的動力學(xué)方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比擬合結(jié)果見圖4，圖4表明式（11）用于描述底物消耗相關(guān)系數(shù)R2為0.986，可以較好的對白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11）底物消耗動力學(xué)進(jìn)行描述，說明所采用的假設(shè)機(jī)理和方程簡化是可行的。

圖4 殘?zhí)菨舛饶Ｐ椭蹬c實(shí)驗(yàn)值比較Fig.4 Comparison of kinetic model with residual glucose concentration date for Streptomyces Albus KD-11

2.3 模型適用性考察

上述模型的參數(shù)求取過程中是以初始菌體濃度為（0.2012±0.5）g·L-1和初始葡萄糖濃度為（48±1）g·L-1的基礎(chǔ)上建立的。為了考察該模型的適用條件，為此選擇初始葡糖糖濃度分別為（45±1）、（55±1）g·L-1初始菌體濃度均控制在（0.2012±0.5）g·L-1范圍其余條件與建立模型時(shí)相同，結(jié)果見圖5，從圖5中可以看出在初始葡萄濃度在45～55g·L-1該模型都能較好的預(yù)測，該模型預(yù)測菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物形成與實(shí)驗(yàn)值平均誤差在分別為5%、4%、8%。

圖5 不同初始葡萄糖濃度條件下實(shí)驗(yàn)值與模型值的比較Fig.5 Comparison of kinetic model with experimental data of Streptomyces Albus KD-11 under various concentration of glucose in the batch fernentation

3 結(jié)論

3.1 ε-PL生成與Streptomyces Albus KD-11生長呈部分生長關(guān)聯(lián)型，菌體生長、ε-PL生成以及葡萄糖的消耗分別適合用Logistic方程、Luedeking Piret方程，類似Luedekin Piret方程予以描述。

3.2 所建立的模型能較好的反映Streptomyces Albus KD-11產(chǎn)ε-PL發(fā)酵過程，在初始菌體濃度為（0.2012± 0.5）g·L-1條件下，初糖濃度在45～55g·L-1之間也適合利用該模型對其發(fā)酵過程進(jìn)行預(yù)測，為該模型的使用提供了邊界條件。

3.3 該模型能為進(jìn)一步對Streptomyces Albus KD-11發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的工藝條件優(yōu)化、發(fā)酵方式改進(jìn)、菌種選育的評價(jià)等進(jìn)一步研究工作提供依據(jù)。

[1]Shima S，Sakai H.Poly-L-lysine produced by Streptomyces. Part III.Chemical studies[J].Agric Biol-Chem，1981，45：2503-2508.

[2]Hiraki J.ε-Polylysine：it’s development and utilization[J]. Fine Chem，2000，29：18-25.

[3]Hirohara H，Takehara M，Saimura M，et al．Biosynthesis of poly（ε-L-lysine）s in two newly isolated strains of Streptomyces sp.[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2006，739（11）：321-331.

[4]Hiraki J，Ichikawa T，Ninomiya S，et al.Barnett.Use of ADME studies to confirm the safety of ε-polylysine as a preservative in food[J].Regul Toxicol Pharmacol，2003，37：328-340.

[5]Hamano Y，Nicchu I，Hoshino Y，et al.Development of gene delivery systems for the ε-poly-L-lysine producer，Streptomyces albulus[J].Biosci Bioeng，2005，99：636-641.

[6]李述日，吳清平，吳軍林.利用細(xì)菌開發(fā)天然功能性食品添加劑研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（2）：425-429.

[7]戚以政，夏杰.生物反應(yīng)工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[8]張建國，陳曉明，熊雙麗.響應(yīng)面分析優(yōu)化ε-聚賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基[J].食品與機(jī)械，2010，26（4）：19-22.

[9]Itzhaki R F.Colorimetric method for estimating Poly-lysine and Poly-arginine[J].Anal Biochem，1972，50：569-574.

[10]MillerG L.Use ofdinitrosalicylic acid reagentfor determination of reducing sugar[J].Anal Chem，1959，31（3）：426-428.

[11]武新，張永勝.Origin在曲線擬合中的應(yīng)用[J].計(jì)算機(jī)工程與應(yīng)用，2005（17）：206-208.

[12]Kahar P，Iwata T，Hiraki J，et al.Enhancement of εpolylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，91（2）：190-194.

[13]張建國，陳曉明，賀新生.靈芝胞外多糖分批發(fā)酵動力學(xué)模型[J].生物工程學(xué)報(bào)，2007，23（6）：1065-1070.

[14]賈士儒.生物反應(yīng)工程原理[M].天津：南開大學(xué)出版社，2003．

Batch fermentation kinetics of ε-Polylysine by Streptomyces Albus KD-11

ZHANG Jian-guo，QIAN Hui-fang，CHEN Xiao-ming
（School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

The kinetic models of the batch fermentation of ε-PL by Streptomyces Albus KD-11 in a 30L-bioreactor were studied.The kinetics model was proposed by using the Logistic equation for cell growth，the Luedeking Piret equation for ε-PL production and the Luedeking-Piret-like equation for consumption of glucose as substrate.Parameters were gained with nonlinear curve fit by Origin 8.1 version.The goodness-of-fit scores R2of models are all greater than 0.980 showed good agreement of predicted values with the experimental values. Calculated results of models were compared satisfactorily with experimental data under various initial glucose concentrations（45～55g/L），the average relative error was no more than 8%.The kinetic model had guiding process in ε-PL fermentation of Streptomyces Albus KD-11.

Streptomyces Albus；batch fermentation；kinetics model；ε-Polylysine

TS202.3

A

1002-0306（2014）12-0222-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.040

2013－09－24

張建國（1973-），男，碩士研究生，講師，研究方向：發(fā)酵工程?；痦?xiàng)目：西南科技大學(xué)青年基金（07zx3125）。