李雪萍，李建宏，孟憲剛，謝佳佳（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

西北漿水中兼性厭氧菌的分離與鑒定

李雪萍，李建宏，孟憲剛*，謝佳佳
（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

采用多點(diǎn)采樣法獲取西北不同地區(qū)的漿水為實(shí)驗(yàn)材料，采用改良的焦性沒食子酸法和平板涂布法分離并純化其中的兼性厭氧微生物，共得到17株菌株，并對(duì)純化后的各菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生化特性研究以及16S rDNA鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漿水中存在多種兼性厭氧菌株，其大多為乳桿菌屬（Lactobacillus）或雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等益生菌，但其中還存在部分雜菌和有害菌；另外還發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的漿水中兼性厭氧菌種類差別較大。

漿水，兼性厭氧菌，分離，鑒定

漿水是西北人民夏季飲食中極受歡迎的一種發(fā)酵蔬菜制品，它由多種益生菌協(xié)同發(fā)酵而成，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，更有清熱解暑之功效[1]，常用來做漿水面等食品。近年來，漿水受到越來越多的科研工作者的關(guān)注，對(duì)其的研究也取得了一系列成果，如不同原料發(fā)酵漿水中微生物數(shù)量的變化及收獲日期的確定[2]、漿水中微生物的分離鑒定[1，3-4]、漿水發(fā)酵過程中硝化還原酶活性和亞硝酸鹽含量的變化關(guān)系的研究[5]等。其中，微生物的分離鑒定是一項(xiàng)非常重要的工作，是深入研究漿水發(fā)酵過程以及實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。但是，綜觀前人的研究可以發(fā)現(xiàn)，在漿水微生物的分離鑒定方面，前人研究普遍存在以下方面的問題：一是所采用的都是單一采樣點(diǎn)的樣品，然而西北地區(qū)地域遼闊，民族眾多，不同地方人民生活習(xí)慣和飲食習(xí)慣差別巨大，漿水的腌制手法也千差萬別，因而，應(yīng)用某一單一采樣點(diǎn)的樣品其代表性很有限；二是前人在微生物方面大多以好氧菌為主要研究對(duì)象，兼性厭氧菌的研究較少，但是在漿水發(fā)酵過程中具有益生保健作用的微生物大部分為兼性厭氧菌。

本課題組曾初步進(jìn)行了一些兼性厭氧微生物方面的研究工作[3]，但采樣點(diǎn)單一，總體工作較為粗糙，大部分都只鑒定到屬。因此，細(xì)致地進(jìn)行漿水兼性厭氧菌的研究，就成為一項(xiàng)極為迫切的工作。另一方面，雖然近些年來出現(xiàn)的高通量測(cè)序技術(shù)及片段多態(tài)性技術(shù)等分子生物學(xué)新技術(shù)在微生物多樣性分析方面展現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)，但是，傳統(tǒng)的純種分離鑒定技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)和提供優(yōu)良的微生物菌種，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，因此，其仍是一項(xiàng)不可替代的重要工作。鑒于此，本研究以西北不同地區(qū)的漿水樣品為材料，進(jìn)行兼性厭氧菌的分離與鑒定，旨在為漿水的進(jìn)一步深入研究和標(biāo)準(zhǔn)化的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品分別從西北五個(gè)地區(qū)取樣，取樣時(shí)參考當(dāng)?shù)厥秤昧?xí)慣，在漿水處于風(fēng)味最佳的階段時(shí)取樣，取得樣品后，儲(chǔ)存于無菌容器，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，立即分離，采樣地點(diǎn)如表1所示；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒北京百泰克生物技術(shù)有限公司，離心柱型；2000bp DNA Ladder美國(guó)Biomiga公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、Tris-飽和酚美國(guó)Sigma公司；瓊脂糖生工BBI生物工程股份有限公司；β-巰基乙醇天津市精細(xì)化工研究所，分析純；異戊醇上海中秦化學(xué)試劑有限公司，分析純；PCR擴(kuò)增試劑由上海生工提供。

表1　樣品來源Table 1　Source of samples

Centrifuge 5418R型臺(tái)式離心機(jī)德國(guó)艾本德公司；MyCycler型PCR儀美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；HE-120型電泳儀、2500型凝膠成像儀上海天能科技有限公司；Nano Drop 2000型紫外分光光度計(jì)美國(guó)賽默飛世爾科技公司；各型加樣槍德國(guó)艾本德公司；Sorvall legend RT型離心機(jī)美國(guó)Kendro實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL；

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、酵母膏5.0g、乙酸鈉5.0g、吐溫80 1mL、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂18g、蒸餾水1000mL。

1.2.2兼性厭氧菌的分離用滅菌生理鹽水稀釋漿水，并在平板上涂布，采用改良的焦性沒食子酸法[6]保持厭氧環(huán)境，37℃下培養(yǎng)48h觀察，稀釋度以平板表面出現(xiàn)單菌落為度。挑選單菌落，再次用劃線法分離純化并鏡檢。挑選菌落形態(tài)統(tǒng)一、菌體顯微形態(tài)一致的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3菌落形態(tài)觀察將已純化的菌株活化后，接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至24～48h時(shí)觀察并記錄菌落形狀、色澤、隆起、表面平整度、邊緣形狀等。

1.2.4革蘭氏染色將活化后的菌體培養(yǎng)至24～ 36h，取樣涂片，用三步法做革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形狀和顏色，分別用Staphyloccocus aureus和Escherichia coli做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.2.5生化特性研究將已純化的各兼性厭氧菌株活化后分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)[7-8]：接觸酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇（V-P）實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果及生化特性研究結(jié)果，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]查詢各兼性厭氧細(xì)菌的分類地位。

1.2.6分子生物學(xué)鑒定

1.2.6.1DNA的提取用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。

1.2.6.2DNA純度及濃度分析用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測(cè)。

1.2.6.3引物設(shè)計(jì)與合成擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F-1492R，由北京華大基因研究中心合成。序列分別為：

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

1.2.7擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)在梯度PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如表2所示。

表2　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 2　PCR amplification reaction system

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.2.8擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)通過瓊脂糖凝膠電泳法完成，DNA Marker為2000bp DNA Ladder，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序交由北京華大基因研究中心完成。

1.2.9序列分析使用軟件DNAMAN4.0進(jìn)行序列分析；利用CLUSTALX（1.8）對(duì)序列分別進(jìn)行比對(duì)；在CLUSTAL中實(shí)現(xiàn)“掐頭去尾”；在BLAST獲得相似序列。

2.1西北漿水中兼性厭氧菌的分離結(jié)果

從西北不同的地區(qū)分離出共17株菌，其中寧夏3株，分別是：MNY-1、MNY-2、MNY-7；慶陽(yáng)3株，分別是：MQY-2、MQY-7、NQY-8；甘南4株，分別是：MGY-4、MGY-5、MGY-7、NGY-2；天水2株，分別是：MTY-2、NTY-4；蘭州5株，分別是：MLY-1、MLY-4、MLY-9、MLY-1、MLY-15。

2.2各菌株菌落形態(tài)觀察及革蘭氏染色

將實(shí)驗(yàn)獲得的17株菌在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～ 48h觀察，可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)菌株菌落形態(tài)呈現(xiàn)典型的細(xì)

2　結(jié)果與分析

菌菌落形態(tài)的特征，均為圓形、白色或米白色，表面光滑。顯微觀察發(fā)現(xiàn)大多為桿菌，僅MLY-9和NTY-4為鏈球菌，且多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.3生化特性研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

生理生化鑒定是基于各種微生物在代謝類型上的差異性。不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)，因而其物質(zhì)代謝的能力就不同，發(fā)酵類型和產(chǎn)物也千差萬別。即使在分子生物學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中仍有很大不可替代的作用[10]，是分子生物學(xué)手段的重要補(bǔ)充。本研究中，選取了接觸酶反應(yīng)，淀粉水解反應(yīng)等10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行鑒定，其結(jié)果和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的描述符合性良好，將相應(yīng)鑒定結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果對(duì)比（見表4），吻合良好，二者相互印證，說明了本研究鑒定準(zhǔn)確。

2.4基因組DNA濃度和純度檢驗(yàn)

圖1　供試菌株基因組DNA電泳圖Fig.1　Genomic DNA electrophoretogram of Bacterial strain for test

所提取的基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖電泳、UVP凝膠成像系統(tǒng)下觀察可以清晰地看到基因組DNA大小約為23kb，且加樣口無亮光，帶型完整，無拖尾現(xiàn)象。通過過紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280并計(jì)算出OD260/OD280的值在1.8～2.0，計(jì)算得DNA濃度為在40～ 80ng/L，并結(jié)合電泳圖譜得出所提DNA純度較高，RNA和蛋白質(zhì)含量較少，無降解。綜上，表明所提DNA完整性好，純度高，符合后續(xù)研究要求。

2.516S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

通過選用原核生物通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出了菌株的16SrDNA區(qū)序列，目的片段在1000～ 2000bp之間，與預(yù)期在1400bp左右相一致，條帶清晰明亮，沒有出現(xiàn)彌散帶和其他雜帶，完整性較好（圖2）。

圖2　供試菌株16S rDNA區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2　Amplification products electrophoretogram for 16S rDNA district of Bacterial strain for test

表3　生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Experimental result of the biochemical characteristic

2.6各菌株種屬的確定

綜合形態(tài)鑒定、生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本研究中所分離的菌株形態(tài)鑒定及生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子鑒定結(jié)果能很好的吻合，說明本研究鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，鑒定結(jié)果如表4所示。

表4　各菌株鑒定結(jié)果Table 4　Identification result of each strain

圖3　供試菌株的聚類分析Fig.3　Cluster analysis of Bacterial Strain for Test

由表4的鑒定結(jié)果及圖3的聚類結(jié)果可知，不同來源的漿水所含的兼性厭氧菌具有相似性，如都含有能代謝產(chǎn)生乳酸的菌株，如采自甘南臨潭、蘭州安寧、慶陽(yáng)環(huán)縣的漿水中都分離到了植物乳桿菌；采自慶陽(yáng)環(huán)縣、中衛(wèi)沙坡頭的漿水分離到了消化乳桿菌；而在甘南臨潭和蘭州安寧漿水中分別分離到了嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌，除此而外，在天水秦安和蘭州安寧的漿水中分離到的無乳鏈球菌、瓊氏不動(dòng)桿菌與中間鏈球菌也具有產(chǎn)乳酸的功能。前人研究結(jié)果顯示，這些菌都具有一定的益生作用，如乳桿菌不僅具有促進(jìn)消化、預(yù)防消化道出血[11]的作用，還具有抵御幽門螺桿菌等致病菌感染的功效[12-13]；而雙歧桿菌則不僅能促進(jìn)消化、修復(fù)胃腸功能，更具有降低血脂、延緩衰老以及抗癌等作用[14-15]。這一結(jié)果從微生物的角度證明了西北漿水確實(shí)具有良好的保健作用，也反應(yīng)西北漿水具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力。同時(shí)，從另一方面，也可以看到，某些來源的漿水還存在某些有害雜菌的污染，如從采自甘南臨潭的樣品中分離到了類腐敗梭菌，中衛(wèi)沙坡頭樣品分離到了水生棒桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌以及蘭州安寧樣品中分離到的大腸彎曲桿菌，這可能是由于漿水原料污染或操作過程不規(guī)范以及貯存不當(dāng)?shù)榷喾N原因引起，這反映了傳統(tǒng)漿水生產(chǎn)中存在的一些問題。值得特別指出的是：天水秦安樣品中未發(fā)現(xiàn)有害菌，這可能是由于該漿水源自工廠化的生產(chǎn)，操作較為標(biāo)準(zhǔn)。這從一個(gè)側(cè)面說明了規(guī)范生產(chǎn)過程對(duì)于漿水的必要性。

除上述外，表4的鑒定結(jié)果還可以看出，蘭州安寧樣品中分離到的兼性厭氧菌相對(duì)最多，有5種，分別為MLY-15、MLY-11、MLY-9、MLY-4、MLY-1，其益生菌也含蓋乳桿菌屬、雙歧桿菌屬以及鏈球菌屬等3個(gè)屬；其次是甘南臨潭樣品中分離到了4種兼性厭氧菌，分別為MGY-4、MGY-7、NGY-2、MGY-5；而慶陽(yáng)環(huán)縣樣品分離到了3株兼性厭氧菌，分別為MQY-7、NQY-8、MQY-2；中衛(wèi)沙坡頭樣品同樣分離到了3株兼性厭氧菌，其分別是MNY-2、MNY-1、MNY-7；天水秦安樣品分離得到2種兼性厭氧菌，分別是NTY-4和MTY-2。綜上，不同來源的漿水，其中所含的厭氧微生物種類有差別。分析其原因可能是由于不同地域群眾在制作漿水時(shí)所選的菜品和制作手法都有很大區(qū)別，如蘭州地區(qū)多采用芹菜作為主要原料，而甘南地區(qū)則習(xí)慣采用土豆和胡蘿卜為主要原料。在制作手法方面，慶陽(yáng)地區(qū)多為投加生菜發(fā)酵，而甘南地區(qū)則將菜品煮熟后用于發(fā)酵。這些都可能是造成不同地域樣品微生物種類不同的因素，張宗舟等[2]的研究也得出了相似的結(jié)論。

3　討論

在蔬菜的發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，其中的微生物群落也發(fā)生改變。一般而言，只有處于發(fā)酵中期的蔬菜，其乳桿菌等有益菌群才占據(jù)主導(dǎo)地位，有害物質(zhì)含量也最低、風(fēng)味最佳，是最適宜食用的時(shí)期而處于發(fā)酵前期和后期的蔬菜都不適于食用[16]。因此，在漿水生產(chǎn)中選取適宜的食用期極為關(guān)鍵，前人在此方面進(jìn)行了大量的研究，選用了亞硝酸鹽的含量、風(fēng)味等各種指標(biāo)來規(guī)范這一階段的選取，而筆者認(rèn)為，在各種指標(biāo)中，最直接和準(zhǔn)確的莫過于漿水中兼性厭氧微生物的狀況。漿水目前尚缺乏這一方面的研究，而實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)，這是必須要攻克的一個(gè)方面。

目前，漿水大多采用自然接種的方式實(shí)現(xiàn)發(fā)酵接種，這就很難根治有害菌污染的頑疾，近些年來，在發(fā)酵蔬菜領(lǐng)域，人工控制接種技術(shù)逐漸被采用，尤其在韓國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，投放發(fā)酵劑發(fā)酵已有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用[17]。在人工控制條件下，添加具有優(yōu)良特性的菌種，不僅能避免有害菌的污染，更能提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量，是值得漿水產(chǎn)業(yè)借鑒的一種優(yōu)秀方法。

4　結(jié)論

綜上，由研究結(jié)果可以看出，漿水中存在多種兼性厭氧微生物，且其大多為益生菌，從微生物學(xué)的角度說明了漿水是一種極具開發(fā)利用潛力的發(fā)酵食品；但另一方面，研究發(fā)現(xiàn)漿水中還存在某些有害菌的污染，分析其是由漿水制作中的不規(guī)范造成的，也說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)的必要性。另外，就不同樣本對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地漿水樣本中的兼性厭氧微生物種類具有相似性。

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Isolation and identification of facultative anaerobes from northwestern jiangshui

LI Xue-ping，LI Jian-hong，MENG Xian-gang*，XIE Jia-jia
（College of Chemistry and Bioengineering Sciences，Lanzhou jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

Jiangshui from different regions of northwestern China was obtained with multiple points sampling method and was used as the experimental material.The improved pyrogallic acid and spread-plate method were applied for separating and purifying of facultative anaerobic microorganism with getting 17 strains.The morphologic observation and the research of gram staining and biochemical characteristic，together with identification of 16S rDNA were used to analyze the purified strains.The major finding was that there were different sorts of facultative anaerobesin the Jiangshui，and most of them belong to Lactobacillus，Bifidobacterium or the other probiotics.And there also existed part of sundry bacteria and harmful bacteria.In addition，it was found that there was a significant difference of the kinds of the facultative anaerobic microorganism in Jiangshui produced in different places.

jiangshui；anaerobic bacteria；isolation；identification

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.038

2013－08－28*通訊聯(lián)系人

李雪萍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

2012甘肅省財(cái)政廳生物專項(xiàng)項(xiàng)目（213001）；2011甘肅省財(cái)政廳高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（211135）。