張莉麗，韓 雪，張?zhí)m威，夏東海，馬崇玉，馮 鎮(zhèn)（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030；.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱50090）

茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在酸奶中的應(yīng)用研究

張莉麗1，韓 雪2，*，張?zhí)m威2，夏東海1，馬崇玉1，馮 鎮(zhèn)1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

為了研究本實(shí)驗(yàn)室制備的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）的應(yīng)用特性，采用兩種不同的TGase添加工藝生產(chǎn)酸奶：第一種采用TGase交聯(lián)乳后加熱鈍化酶活力，然后添加發(fā)酵劑制備酸奶；第二種采用活性TGase與發(fā)酵劑同時(shí)添加到乳中的方法生產(chǎn)酸奶。通過(guò)對(duì)比這兩種酸奶和對(duì)照樣品（未添加TGase）的發(fā)酵時(shí)間、質(zhì)構(gòu)變化、乳清析出量和感官評(píng)價(jià)，確定此酶在酸奶中的添加條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性TGase交聯(lián)酸奶的堅(jiān)實(shí)度、粘度、乳清析出量和感官評(píng)價(jià)都有很大的改善，并且確定此TGase最適添加量為30U/L。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，酸奶，質(zhì)構(gòu)特性，感官評(píng)價(jià)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，EC2.3.2.13，R-glutaminyl-peptide：amnieγ-glutamyl-transferase，簡(jiǎn)稱(chēng)TGase）又名轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，它通過(guò)誘導(dǎo)肽段之間ε（γ-谷氨酰）賴(lài)氨酸鍵作用，催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性和結(jié)構(gòu)，并能通過(guò)引入賴(lài)氨酸提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，生產(chǎn)出滿(mǎn)足人們需求的高營(yíng)養(yǎng)食品[1]，因此被譽(yù)為“21世紀(jì)超級(jí)黏合劑”。

酸奶具有良好的益生功能，贏(yíng)得了廣大消費(fèi)者的青睞，但生產(chǎn)廠(chǎng)家為了提高其穩(wěn)定性已經(jīng)采取了一些方法改善其質(zhì)地，如增加非脂固形物或/和蛋白質(zhì)含量，或者添加一些凝膠物質(zhì)。但是一些國(guó)家不允許添加穩(wěn)定劑或可能產(chǎn)生毒性成分的添加劑，因此TGase已經(jīng)被用來(lái)改善酸奶的凝膠特性和質(zhì)地[2-4]。本課題組利用MgCl2脅迫提高了茂原鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)TGase的產(chǎn)量[5]，并且通過(guò)分離純化，得到了電泳純的TGase，通過(guò)研究它的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，它比現(xiàn)有報(bào)道的鏈霉菌TGase具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性[6]。為了進(jìn)一步研究此酶的應(yīng)用特性，本文對(duì)比兩種TGase添加工藝，即分別采用交聯(lián)后鈍化酶活力再發(fā)酵和與發(fā)酵劑同時(shí)添加活性TGase兩種工藝生產(chǎn)酸奶，通過(guò)研究?jī)煞N酸奶和對(duì)照樣品（未添加TGase）的發(fā)酵時(shí)間、堅(jiān)實(shí)度、粘度、乳清析出量和感官評(píng)價(jià)，確定此酶在酸奶中的添加條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 實(shí)驗(yàn)室自制；牛奶 哈爾濱市香坊農(nóng)場(chǎng)；白砂糖 上海農(nóng)豐實(shí)業(yè)有限公司一分公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 本實(shí)驗(yàn)室保存。

PB-10型酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TAX-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀（TPA） 英國(guó)Stable Micro Systems公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-40IC型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；3-30K型冷凍離心機(jī) Sigma公司；高壓均質(zhì)機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凝固型酸奶的生產(chǎn) 工藝流程如下所示：

乳酸菌純培養(yǎng)物→母發(fā)酵劑→生產(chǎn)發(fā)酵劑

↓

原料奶預(yù)處理→標(biāo)準(zhǔn)化→配料→均質(zhì)→殺菌→冷卻→加發(fā)酵劑→分裝→保溫發(fā)酵→冷卻→后熟→凝固型酸奶。

1.2.2 酸奶的制備 工藝操作如下所示：

a.對(duì)照樣品：發(fā)酵過(guò)程不加TGase，只接種發(fā)酵劑。

b.活性TGase交聯(lián)酸奶：在添加發(fā)酵劑的同時(shí)，分別按照20、30、40、50、60U/L的濃度添加TGase，發(fā)酵后測(cè)量酸奶的各個(gè)指標(biāo)。

c.TGase鈍化酸奶：乳經(jīng)殺菌冷卻后分別按照20、30、40、50、60U/L的濃度添加TGase，在40℃反應(yīng)2h，加熱到95℃，保持5min，使酶鈍化，加入發(fā)酵劑，發(fā)酵后測(cè)量酸奶的各個(gè)指標(biāo)，與a、b的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3 酸奶凝乳時(shí)間的確定 將對(duì)照樣品、活性TGase交聯(lián)酸奶和添加TGase后鈍化酸奶分別在43℃保溫發(fā)酵至pH4.5，記錄發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 酸奶質(zhì)構(gòu)（TPA）的測(cè)評(píng)方法 酸乳凝固后放入冰箱，4℃冷藏，冷藏24h后，采用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)量酸乳的堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度、粘附性指數(shù)。TPA測(cè)定參數(shù)如下：測(cè)定前探頭速度1.00mm/s；測(cè)定時(shí)探頭速度1.00mm/s；測(cè)定后探頭速度1.00mm/s；測(cè)定距離20mm；探頭柱型AEC，盤(pán)徑35mm；感應(yīng)力Auto-5g；數(shù)據(jù)攫取速度200pps。

1.2.5 乳清析出量測(cè)定 乳清析出量即測(cè)定酸乳膠體脫水收縮作用的敏感性（Susceptibility to Syneresis，STS）：在6℃下將100mL酸乳小心傾入到一個(gè)120目不銹鋼網(wǎng)篩中，2h后收集瀝出的乳清，用100mL量筒量出體積[7]。計(jì)算公式如下：

1.2.6 感官評(píng)分 經(jīng)過(guò)后熟的酸奶由5位食品專(zhuān)業(yè)研究生和6位普通消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的色澤、氣味、滋味和組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）評(píng)分，以100分制填寫(xiě)評(píng)分表，90～100分（很好）、70～80分（較好）、50～60（一般）、30～40（較差）、10～20（很差）。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase不同添加方式對(duì)凝乳時(shí)間的影響

當(dāng)酸奶pH下降到4.5時(shí)，酸奶完全凝固。對(duì)照樣品（TGase添加量為0U/L）和添加少量活性酶（20U/L和30U/L）酸奶樣品的凝乳時(shí)間在245～260min之間，添加高濃度活性酶的酸奶樣品凝乳時(shí)間延長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。這與Lorenzen[8]、F?rgemand[9]和Ozer等[10]的研究結(jié)果一致。他們發(fā)現(xiàn)向酸奶中添加活性TGase會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間。F?rgemand等[9]認(rèn)為酸奶中蛋白質(zhì)交聯(lián)影響了乳酸菌對(duì)低分子量肽的利用，抑制了乳酸菌生長(zhǎng)，因此延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間。但是本文的研究結(jié)果與B?nisch等[11]的發(fā)現(xiàn)不同，他們認(rèn)為這種矛盾的結(jié)果是由于實(shí)驗(yàn)條件不同造成的。添加TGase后鈍化酸奶的凝乳時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)照樣，隨著酶添加量的增大，凝乳時(shí)間變化不明顯。圖1還表明，加酶后鈍化與添加活性酶酸奶相比，前者的凝乳時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后者。

圖1 TGase不同添加方式對(duì)凝乳時(shí)間的影響Fig.1 Addition methods of TGase on the yogurt curding time

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensitive evaluation

2.2 TGase不同添加方式對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響

利用質(zhì)構(gòu)儀來(lái)測(cè)試酸奶的堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度、粘附性指數(shù)。由表2可以看出，在活性TGase交聯(lián)酸奶中，酶添加量越大，酸奶凝膠強(qiáng)度越大，酸奶越稠厚，同時(shí)，細(xì)膩度也越差；當(dāng)活性TGase添加量達(dá)40U/L時(shí)，測(cè)得其堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度、粘附性指數(shù)幾乎為對(duì)照樣品（TGase添加量為0U/L）的二倍。這表明，添加TGase導(dǎo)致乳中的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，從而增加產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度和粘度。Gauche等[12]認(rèn)為質(zhì)構(gòu)改善是由于TGase交聯(lián)蛋白形成ε-（γ-glutamyl）lysine造成的。由表2還可以看出，在添加等量TGase時(shí)，TGase鈍化酸奶的堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度、粘附性指數(shù)均低于活性TGase酸奶。當(dāng)TGase添加量較小時(shí)，TGase鈍化酸奶的堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度和粘附性指數(shù)與對(duì)照樣品差異不顯著。只有當(dāng)TGase的添加量達(dá)到60U/L以上時(shí)，才能明顯提高酸奶的堅(jiān)實(shí)度、稠度、粘度和粘附性指數(shù)。這與Sanli和Lorenzen等的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為凝固型酸奶發(fā)酵過(guò)程中，活性TGase可以提高其凝膠強(qiáng)度[3，8]。

表2 兩種酸奶質(zhì)構(gòu)分析對(duì)比Table 2 The contrasting texture of two kinds of yoghurt

2.3 TGase不同添加方式對(duì)乳清析出量的影響

TGase不同添加方式對(duì)酸奶乳清析出量影響的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，乳清析出量隨著酶添加量增大而減小，這是由于TGase引發(fā)乳中的蛋白質(zhì)發(fā)生永久交聯(lián)，導(dǎo)致凝膠滲透性降低，最終使酸奶具有更緊密、穩(wěn)定的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，更多的自由水被鎖在酸奶凝膠的網(wǎng)絡(luò)中。當(dāng)TGase添加量相同時(shí)，活性TGase交聯(lián)酸奶的乳清析出量明顯低于TGase鈍化酸奶，這可能是由于鈍化酸奶的蛋白質(zhì)交聯(lián)程度低于活性TGase交聯(lián)酸奶造成的。

圖2 TGase不同添加方式對(duì)乳清析出量的影響Fig.2 Addition methods of TGase on the whey syneresis

2.4 TGase不同添加方式對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響

由圖3可知，活性TGase交聯(lián)酸奶實(shí)驗(yàn)中，TGase添加量較低（20U/L）的酸奶得分與對(duì)照組（TGase添加量為0U/L）差異不顯著；TGase添加量在30U/L的酸奶評(píng)分最高，因?yàn)槠淠榻Y(jié)實(shí)，表面比較光亮，質(zhì)地也較細(xì)膩，酸奶的香味濃重；而添加量過(guò)大（50、60U/L）的酸奶由于結(jié)構(gòu)較松散、切面較碎、呈沙粒狀，不容易被評(píng)委接受，因此得分較低。兩種酸奶的對(duì)比可知，TGase被鈍化酸奶的感官得分要低于活性TGase交聯(lián)酸奶，只有添加量在40U/L的兩個(gè)酸奶評(píng)分幾乎相同。由以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，活性TGase交聯(lián)酸奶中酶的最適添加量為30U/L，而TGase鈍化酸奶，其最適添加量為40U/L。

圖3 感官評(píng)價(jià)對(duì)比圖Fig.3 Sensitive evaluation

3 結(jié)論

目前有很多提高凝固型酸奶穩(wěn)定性的方法，包括添加乳粉，通過(guò)超濾或添加乳蛋白來(lái)提高乳中的蛋白質(zhì)含量、添加一些穩(wěn)定劑來(lái)控制酸奶的質(zhì)構(gòu)缺陷，從而提高酸奶的濃度和質(zhì)地。目前的研究表明，TGase交聯(lián)乳中蛋白是替代調(diào)節(jié)固形物或添加穩(wěn)定劑的有效方法。本文通過(guò)向酸奶中添加TGase，并且采用交聯(lián)后鈍化和與發(fā)酵劑同時(shí)添加活性TGase兩種工藝生產(chǎn)酸奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性TGase交聯(lián)酸奶的堅(jiān)實(shí)度、粘度、乳清析出量和感官評(píng)價(jià)有很大的改善，并且確定此TGase最適添加量為30U/L。另外，雖然添加TGase交聯(lián)后再鈍化的工藝也能改善酸奶的質(zhì)構(gòu)，但TGase的添加量較大；而且當(dāng)TGase添加量過(guò)大時(shí)，感官評(píng)價(jià)分值很低。因此，TGase的添加方式為添加發(fā)酵劑的同時(shí)加入TGase，最適添加量為30U/L。

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Application of transglutaminase from Streptomyces mobaraense in yoghurt

ZHANG Li-li1，HAN Xue2，*，ZHANG Lan-wei2，XIA Dong-hai1，MA Chong-yu1，F(xiàn)ENG Zhen1
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

In order to study the properties of transglutaminase prepared in the laboratory，two different addition techniques of TGase were compared.One was to add fermentation agent after crosslinking milk by TGase following inactivation TGase by heat treatment，the other was to add TGase and fermentation agent to milk at the same time.These adding conditions of TGase were determined by comparing the two kinds of yogurt and control samples（without TGase）.Fermentation time，texture changes，whey precipitation and sensory evaluation of yogurt were compared.Results showed that the firmness，viscosity，whey precipitation and sensory evaluation of the yogurt crosslinked by the active TGase were greatly improved，and the optimum adding amount of TGase was 30U/L.

transglutaminase；yogurt；textural properties；sensory evaluation

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0210-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.037

2013－12－18 *通訊聯(lián)系人

張莉麗（1981－），女，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301545）。