婁永江，柳 麗（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

即食海蜇中特定腐敗菌的分離及PCR檢測

婁永江，柳 麗
（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

利用傳統(tǒng)的微生物檢測方法及PCR技術(shù)快速檢測即食海蜇中的優(yōu)勢腐敗菌，檢測結(jié)果顯示：PCR檢測與傳統(tǒng)方法鑒定出的結(jié)果一致，即食海蜇的特定腐敗菌為芽孢桿菌、假單胞菌以及腐敗希瓦氏菌。

PCR技術(shù)，即食海蜇，特定腐敗菌

即食海蜇是一種低脂肪、高蛋白的食品，深受廣大消費者的喜愛，因此也成為眾多學(xué)者研究的一個方向[1-5]。由于這種海產(chǎn)品含水量高、營養(yǎng)好，容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，而微生物則是引發(fā)產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。因此，探索導(dǎo)致即食海蜇變質(zhì)的微生物種類，才能有效地對產(chǎn)品的品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，這也是提高即食海蜇產(chǎn)品質(zhì)量的前提。因微生物種類繁多，國外學(xué)者通過對水產(chǎn)品中腐敗微生物進(jìn)行的長期研究，提出來特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）[6]的概念。

一直以來，微生物的鑒定都是采取傳統(tǒng)的方式：通過培養(yǎng)基對菌種進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，之后從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征等進(jìn)行菌種鑒定[7]，這個過程費時費力，而且結(jié)果的準(zhǔn)確性受到了諸多因素的影響[8]。近年來隨著分子技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)來解決微生物分類鑒定變得簡單易行，現(xiàn)在比較常見的是利用PCR技術(shù)快速鑒定菌種。PCR技術(shù)[9-10]即是聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction），于20世紀(jì)90年代美國學(xué)者研究提出，此技術(shù)已被廣大學(xué)者運用研究。目前，國內(nèi)外還暫未發(fā)現(xiàn)有人將PCR技術(shù)運用到即食海蜇的研究上。本實驗主要利用傳統(tǒng)方法及PCR技術(shù)檢測即食海蜇中的特定腐敗菌，為研究即食海蜇制品的貯藏保鮮提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

即食海蜇 寧波市天峰水產(chǎn)有限公司；平板計數(shù)瓊脂（PAC）培養(yǎng)基 青島海博生物公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、10×PCR Buffer、dNTP、DNA聚合酶Taq、MgCl2、超純水、引物27F、1492R等 上海捷瑞生物工程有限公司。

TY10TC-512型PCR擴(kuò)增儀 英國TECHNE；MP2000D型電子天平 上海實驗儀器總廠；BCD-256H型冰箱 海爾集團(tuán)；W-CJ-IB型凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海實驗儀器廠；150A型生化培養(yǎng)箱 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；DYY-6C型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 南京惠普生物公司；Champgel 6000型凝膠成像儀 美國BIO公司；YM100Z型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化實驗 在無菌條件下，取貯存期為200d、已明顯腐敗的即食海蜇制品，稱取即食海蜇及溶液100g，用無菌研缽搗碎后準(zhǔn)確稱取25g，加入到225mL的無菌蛋白胨溶液（內(nèi)含10g的無菌玻璃珠），充分振蕩15min后取1mL上清液，進(jìn)行1∶10梯度實驗稀釋。選取10-5濃度的溶液，分別放置在培養(yǎng)基上進(jìn)行微生物涂布培養(yǎng)。根據(jù)生食水產(chǎn)品常含細(xì)菌的種類，挑選合適的培養(yǎng)基，充分培養(yǎng)出即食海蜇中含有的細(xì)菌種類，所挑選培養(yǎng)基如下：

表1 幾種常見水產(chǎn)品菌的選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and culture conditions of several common aquatic bacteria

利用不同的選擇培養(yǎng)基對即食海蜇所含菌進(jìn)行培養(yǎng)，挑選相應(yīng)菌種的典型生長菌落，在平板培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，直至得到純化的單菌落。之后利用伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊[11]，對于得到的單個菌落進(jìn)行菌落特征和菌體形態(tài)的鑒定。

1.2.2 細(xì)菌的生理生化實驗測定 依據(jù)細(xì)菌的一般常用鑒定方法[12]，對所得的菌落進(jìn)行過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗、葡萄糖氧化發(fā)酵實驗、精氨酸雙水解酶實驗、V-P（乙酰甲基甲醇）實驗、MR（甲基紅）實驗。

1.2.3 即食海蜇細(xì)菌DNA的提取 利用QIAGEN公司提取基因組DNA試劑盒直接提取DAN。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 在PCR擴(kuò)增中，選用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以1.2.3中提取的基因組DNA為模板，選擇50μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.選擇一個合適的地方進(jìn)行交流也很重要?；_斯建議家長選擇安靜的房間以避免被打擾。如果在談話中就某些問題達(dá)成一致，就讓孩子寫在紙上，并放在一個顯眼的位置，以約束雙方共同遵守。

本文中PCR反應(yīng)體系的組成為：引物各1.0μL，10×PCR Buffer 5.0μL，模版DNA 1.0μL，DNA Taq聚合酶0.4μL，MgCl25.0μL，dNTP 8.0μL，超純水28.6μL。

PCR反應(yīng)的步驟：首先94℃預(yù)變性5min，之后有個30個步驟的循環(huán)，這個循環(huán)的程序是94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸80s。這30個循環(huán)結(jié)束之后，72℃最終延伸10min。

PCR結(jié)束之后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測擴(kuò)增效果。

1.2.5 DNA測序 在凝膠成像系統(tǒng)中觀看PCR擴(kuò)增結(jié)果，檢測擴(kuò)增是否成功。對于成功的亮帶，利用回收試劑盒回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司反饋的序列結(jié)果，與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行對比分析，選擇相似性高于97%的菌屬，再將PCR分析結(jié)果與傳統(tǒng)微生物分析的結(jié)果對比，看其二者之間的差異與共同性。

表2 即食海蜇分離出的菌株形態(tài)及特征Table 2 Characteristics of strains isolated from ready-to-eat jellyfish

表3 即食海蜇中各類腐敗菌的生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria from ready-to-eat jellyfish

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化后細(xì)菌的菌體形態(tài)和菌落特征

對所獲細(xì)菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察所獲得的菌體在培養(yǎng)基上的菌落以及它的菌體形態(tài)，如表2所示。

2.2 細(xì)菌生理生化實驗

根據(jù)菌種的細(xì)菌形態(tài)以及菌落特征，結(jié)合各種生理生化實驗結(jié)果的鑒定，再查閱《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，可以鑒定出A5、G3、I9是芽孢桿菌屬，G5、I3是腐敗希瓦氏菌，F(xiàn)3是假單胞菌。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

利用基因組提取試劑盒提取A5、F3、G5、G3、I3、I9的DNA，利用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增其DNA片段，擴(kuò)增結(jié)果于做凝膠成像系統(tǒng)分析拍照，結(jié)果如圖1所示。實驗結(jié)果顯示，擴(kuò)增的6個樣品中，都獲得了長度約在1600kbp左右的亮帶，證明了本次實驗獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是實驗菌株樣品的16S rDNA的基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of PCR

2.4 基因序列對比分析

用回收試劑盒將PCR擴(kuò)增的結(jié)果亮帶進(jìn)行切膠回收，回收物交于上海生工進(jìn)行分析序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫里，將所得的16S rDNA序列進(jìn)行Blast分析，選取相似度高于97%的菌株。將分析結(jié)果與傳統(tǒng)的實驗方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行對比，比較兩者檢驗結(jié)果是否一致。

表4 16S rDNA序列對比分析及與傳統(tǒng)檢測方法對比Table 4 The results of comparative analysis about 16S rDNA and traditional detection methods

通過表4分析可知，F(xiàn)3與假單胞菌的同源性最高，為100%相似，其次A5、G3、I9與芽孢桿菌同源性最高，達(dá)到了99%，G5、I3與腐敗希瓦氏菌的同源性最高，達(dá)到了98%。研究結(jié)果表明，即食海蜇的優(yōu)勢腐敗菌為芽孢桿菌、假單胞菌以及腐敗希瓦氏菌，這與傳統(tǒng)方法鑒定出的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

在本實驗中，從即食海蜇中分離出來6種菌株，經(jīng)過傳統(tǒng)微生物鑒別如菌體特征、菌落形態(tài)、生理生化實驗以及PCR擴(kuò)增分子生物法分析，鑒定這6種菌株分別是假單胞菌、腐敗希瓦氏菌以及芽孢桿菌，傳統(tǒng)檢測方法與PCR檢測結(jié)果一致，為以后即食海蜇的保鮮技術(shù)提供了依據(jù)。

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Specific spoilage organism of instant jellyfish’s isolation and PCR technique

LOU Yong-jiang，LIU LI
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The conventional microbiological detection methods and PCR techniques was used to determine rapidly the specific spoilage organism of instant jellyfish.The results showed that：the identification consequence of PCR and traditional method was consistency，and the specific spoilage organism of instant jellyfish was Bacillus，Pseudomonas and corruption Shewanella.

PCR technique；instant jellyfish；the specific spoilage organism

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0207-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.036

2013－09－11

婁永江（1965-），男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全控制。

寧波大學(xué)大學(xué)生科研創(chuàng)新計劃項目（2011SRIP005）資助。