蔣文鴻，嚴(yán) 斌，陶永勝（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌71100；.中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

昌黎赤霞珠葡萄相關(guān)釀酒酵母的分離與篩選

蔣文鴻1，2，嚴(yán) 斌2，陶永勝1，*
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌712100；2.中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

以昌黎地區(qū)赤霞珠葡萄為樣本，從中分離出5種酵母。通過菌落特征、菌體形態(tài)及賴氨酸培養(yǎng)基鑒定，初步確定其中4株為葡萄酒釀酒酵母。通過高濃度酒精（10%～18%）、高濃度SO2（100～400mg/L），高糖濃度（10%～60%）和高溫（37、42℃）的耐受性實驗，初步篩選出兩株可耐受14%濃度酒精、300mg/L SO2、50%的葡萄糖濃度及42℃高溫的菌株。與市售的兩種釀酒酵母進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵實驗，將所得酒樣進(jìn)行理化分析及感官品評，結(jié)果表明菌株a發(fā)酵力強，較市售酵母菌發(fā)酵后揮發(fā)酸含量低，殘還原糖含量為0.40g/L，且葡萄酒感官評價最高。最終選出菌株a為赤霞珠葡萄釀酒酵母最佳菌株。

昌黎，葡萄酒，釀酒酵母，菌株篩選，發(fā)酵

葡萄酒是一種營養(yǎng)豐富的低酒精度發(fā)酵飲料，是新鮮葡萄或葡萄汁的發(fā)酵產(chǎn)品，具有很高的保健功能[1]。葡萄酒的發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物參與的生物化學(xué)變化過程，酵母菌是發(fā)酵過程的主導(dǎo)微生物[2]。釀酒酵母的發(fā)酵特性因菌株不同而存在明顯差異[3]，對底物的利用和生成的物質(zhì)也不同，從而使發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)存在差異，賦予產(chǎn)品獨特的風(fēng)味[4-5]。

目前我國在葡萄酒酵母的研究和利用方面發(fā)展還遠(yuǎn)不如生產(chǎn)方面的發(fā)展迅速，葡萄酒生產(chǎn)所用菌種大部分依賴進(jìn)口，造成在品種和風(fēng)格上比較單一，地域特色不突出[6-8]。

昌黎是中國葡萄栽培的重要區(qū)域，也是釀酒葡萄原料和葡萄酒的主要生產(chǎn)基地之一。可能存在與地方優(yōu)質(zhì)名牌葡萄酒的品種形成相關(guān)的天然優(yōu)良酵母菌株[9]。基于此，通過耐受性實驗及葡萄酒發(fā)酵實驗，對昌黎地區(qū)赤霞珠葡萄皮上的天然酵母進(jìn)行了篩選，從中篩選出適合本土特色葡萄酒釀造的優(yōu)良的酵母菌株。本研究對葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母種質(zhì)資源的探明以及篩選優(yōu)良的本地酵母菌株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昌黎赤霞珠葡萄 中糧華夏長城葡萄酒有限公司提供；丹寶利高效活性葡萄酒釀酒干酵母 廣西丹寶利酵母有限公司；VR5釀酒酵母 法國Laffort（拉氟德）；檸檬酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞硫酸、鹽酸、斐林試劑A、斐林試劑B、次甲基藍(lán)、葡萄糖、酚酞 均為分析純。

GZX-9240 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥機、SPX-250BZ型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC014-11-018-01（X）型立式壓力蒸汽滅菌器筒 上海云泰儀器有限公司；AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；BCD-649WADV型電冰箱 青島海爾股份有限公司；BA80-C型生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；L1V型mini紫外可見分光光度計 日本日立。

1.2 培養(yǎng)基配方

YPD瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20min。液體YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH自然，121℃滅菌20min。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，儲液A 40mL/1000mL，儲液B 1mL/1000mL，調(diào)pH至6.0～6.5，再加入瓊脂2%，滅菌后冷卻至50～ -60℃，加儲液C 1mL/1000mL，混勻后倒平板。

儲液A：磷酸二氫鉀5.5g，氯化鉀4.25g，氯化鈣1.25g，硫酸鎂1.25g，定容至400mL，121℃滅菌20min后4℃保存。使用時按40mL/1000mL加入。

儲液B：氯化鐵0.25g，硫酸錳0.25g，定容至100mL，121℃滅菌20min后4℃保存。使用時按1mL/1000mL加入。

儲液C：0.44g溴甲酚綠溶于10mL無菌水和10mL 95%酒精中，配制儲液C的所有器具都必須滅菌。配制好的C液不需要滅菌，使用時按1mL/1000mL加入。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自來水1000mL，121℃滅菌20min。

LM培養(yǎng)基（賴氨酸培養(yǎng)基）：購自英國Oxoid公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母的富集培養(yǎng)及分離 剔除腐爛、發(fā)霉、破損的果粒及雜物，稱取均勻完整葡萄果粒6.0g，加入100mL無菌的YPD液體培養(yǎng)基中，振搖，置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。在無菌室內(nèi)將富集液用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋至10-7，分別涂布于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離純化。生化培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)5d后觀察，記錄菌落顏色和形態(tài)，將具有酵母形態(tài)的菌株轉(zhuǎn)接并經(jīng)多次劃線純化，獲得純化菌株[10]。純化菌株保藏于試管斜面中，備用。

1.3.2 杜氏管發(fā)酵實驗 麥芽汁發(fā)酵法：將活化傳代的酵母菌接入帶有杜氏管的麥芽汁（10Brix）培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48h，初篩出產(chǎn)氣好的酵母菌株，接種量為1.0×107cfu/mL。用顯微鏡觀察其活細(xì)胞形態(tài)，篩選出酵母菌。

1.3.3 賴氨酸培養(yǎng)基鑒定 釀酒酵母不能利用賴氨酸作為氮源，因而在賴氨酸培養(yǎng)基上不能生長。將經(jīng)過純化和鏡檢的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基活化24h后，按照1%接種量接種到5mL無菌水中進(jìn)行饑餓處理，7d后接種到賴氨酸平板培養(yǎng)基，并置于27℃培養(yǎng)5d后觀察是否有菌落生長，培養(yǎng)48h后沒有菌落出現(xiàn)的繼續(xù)培養(yǎng)，直到15d后仍無菌落生長可確定是釀酒酵母。

1.3.4 篩選菌株的耐受性實驗

1.3.4.1 高濃度酒精的耐受性實驗 將滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基降溫至40℃左右，在無菌操作室內(nèi)按10%、12%、14%、16%、18%（v/v）加入乙醇，分別接種新鮮培養(yǎng)的酵母菌單菌落在YPD固體平板進(jìn)行生長實驗，生化培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)，7d后以生長狀況表征其酒精和SO2耐受性。

1.3.4.2 SO2耐受性實驗 將滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基降溫至40℃左右，在無菌操作室內(nèi)按100、200、250、300、350、400mg/L的濃度加入SO2，分別接種新鮮培養(yǎng)的酵母菌單菌落在YPD固體平板進(jìn)行生長實驗，生化培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)，7d后以生長狀況表征其SO2耐受性。

1.3.4.3 高溫耐受性實驗 移取15mL融化的YPD瓊脂培養(yǎng)基于10支試管中，傾斜放置，待培養(yǎng)基凝固，分別接種新鮮培養(yǎng)的酵母菌單菌落，各取5支置于37、42℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7d后以生長狀況表征其高溫耐受性。

1.3.4.4 糖濃度耐受實驗 在無菌室用移液管分別移取15mL糖濃度為10%、20%、30%、40%、50%和60%（m/v）的YPD瓊脂培養(yǎng)基于試管中，待培養(yǎng)基凝固，分別接種新鮮培養(yǎng)的酵母菌單菌落。置于生化培養(yǎng)箱28℃進(jìn)行生長實驗，以生長狀況表征其對不同濃度糖的耐受性。培養(yǎng)7d后觀察生長情況[8]。

1.3.5 葡萄酒發(fā)酵實驗 將篩選得到的酵母菌a、d與市售的兩種酵母菌丹寶利高效活性干酵母、VR5釀酒酵母同時進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵實驗：a菌種發(fā)酵一號罐，d菌種發(fā)酵二號罐，丹寶利高效活性干酵母發(fā)酵三號罐，VR5酵母發(fā)酵四號罐。篩選出的酵母經(jīng)菌落計數(shù)后換算成固態(tài)接種量，經(jīng)計算與市售酵母添加量相同，均為0.2g/kg，每組設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。每天壓帽后觀察葡萄酒顏色變化、記錄香氣差異和口味的變化，每天每罐測兩次比重、溫度，發(fā)酵溫度控制在20～25℃[11-13]。

1.3.6 酵母發(fā)酵葡萄酒感官評價 用比重計測量葡萄酒比重，數(shù)值在0.993～0.996時發(fā)酵結(jié)束。分離皮渣并對皮渣進(jìn)行壓榨。將葡萄酒轉(zhuǎn)移到用亞硫酸溶液清洗過的瓶子中排盡空氣，下膠儲存。下膠完全后，從色澤、香氣、香味三個方面對葡萄酒進(jìn)行感官評價[14-15]。

評價小組選擇食品學(xué)院教師和學(xué)生共40人，對其進(jìn)行詞匯的介紹與演示、描述標(biāo)度的介紹、初步實踐、較小差異的訓(xùn)練和最后實踐等培訓(xùn)，最后選擇20名參加實驗人員為實驗的品評員。每種酒樣用高腳杯呈送，并用3位隨機數(shù)字編號，同答題紙一并隨機呈送給評價小組。品評員在單獨的品評室內(nèi)品嘗葡萄酒，對每種樣品的各種感官指標(biāo)進(jìn)行打分。實驗重復(fù)2次進(jìn)行[16]。葡萄酒感官鑒評標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.7 酵母發(fā)酵葡萄酒理化指標(biāo)測定 葡萄酒酒度的測定采用密度瓶法法定；葡萄酒總糖及殘?zhí)堑臏y定采用斐林試劑法；葡萄酒揮發(fā)酸的測定采用蒸餾滴定法；總酸的測定采用氫氧化鈉滴定法；SO2測定采用直接碘量法；干浸出物測定采用密度瓶法；色度測定采用分光光度法；單寧測定采用分光光度法；總酚測定采用分光光度法[17-19]。

表1 葡萄酒感官鑒評標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The assessment standards of sensory evaluation for wine

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的富集培養(yǎng)及分離

從昌黎赤霞珠釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)不同地塊收集葡萄果粒80份，每份100g，收集于滅菌袋中0～4℃保存。經(jīng)過富集培養(yǎng)和劃線分離，鏡檢共分離得到酵母238株。

2.2 杜氏管發(fā)酵實驗

對分離得到的238株酵母菌進(jìn)行杜氏管產(chǎn)氣實驗，結(jié)果顯示，在48h內(nèi)充滿氣體的有61株。進(jìn)一步進(jìn)行菌株驗證實驗。

2.3 顯微鏡鏡檢

酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等，比細(xì)菌的單細(xì)胞個體要大得多[17]。菌株a、c、e的形態(tài)均為卵圓形，菌株b形態(tài)為球形，d為橢圓形，是酵母菌的常規(guī)形態(tài)，表明五株菌株均為酵母菌，見圖1?；罹R檢所分離的菌株初步確定五種不同的菌株，分別命名為a、b、c、d、e。

圖1 五株菌株的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of five species strains

2.4 賴氨酸培養(yǎng)基鑒定

將酵母菌菌株接種到賴氨酸培養(yǎng)基后，觀察其生長情況。表2是賴氨酸培養(yǎng)基鑒定實驗各菌株生長狀況。

可以看出不能利用賴氨酸作為氮源生長的菌株有a、b、c、d，而菌株e在饑餓處理后在賴氨酸培養(yǎng)基上能夠正常生長，證明其能夠利用賴氨酸作為氮源生長。故確定菌株a、b、c、d是釀酒酵母。

表2 賴氨酸培養(yǎng)基鑒定實驗結(jié)果Table 2 Results of lysine experimental test

2.5 優(yōu)良酵母的耐性

對a、b、c、d 4株菌株進(jìn)行高酒精濃度（10%～18%）、高濃度SO2（100～400mg/L），高糖濃度（10%～60%）和高溫（37℃和42℃）的耐受性實驗，結(jié)果見表3～表6。

由表3可知c菌株可耐受10%～12%的酒精，該濃度范圍內(nèi)大量生長，14%以上的酒精濃度環(huán)境下不生長；b、d菌株均可耐受10%～14%的酒精，其中d菌株較b菌株先出現(xiàn)菌落，d大量生長，b只有微量生長；a菌株可耐受10%～18%的酒精，18%酒精濃度下微量生長。4菌株中a菌株的酒精耐受性最強，較山東、甘肅等地區(qū)篩選出的耐受16%酒精濃度的酵母耐受性高[17]。

表3 受試菌株對高濃度酒精耐受性測試結(jié)果Table 3 Results of tolerance test for strains by high concentration alcohol

由表4可知在100mg/L的SO2中四種菌株均大量生長，且均不耐受400mg/L的SO2。菌株a最高可耐受350mg/L的SO2，與其他地區(qū)篩選實驗所得酵母菌的最高耐受性水平持平[10，17]；b、d菌株最高可耐受300mg/L的SO2；c菌株最高可耐受250mg/L的SO2。

由表5得出四種菌株都可在10%～50%濃度的葡萄糖中生長，狀態(tài)良好。60%濃度葡萄糖環(huán)境下都不生長，與目前釀酒酵母葡萄糖耐受性強度相當(dāng)[18]。

由表6得出在37℃條件下四種菌株都可生長，其中a菌株生長狀態(tài)最好，其次為為b、d菌株。42℃條件下只有a、d兩菌株可生長；b、c不生長。

結(jié)合各耐性實驗結(jié)果得出a、d兩菌株對高酒精濃度、高SO2濃度、高濃度葡萄糖和高溫的耐受性最好。與龐紅勛等[8]從天津地區(qū)產(chǎn)的葡萄中分離篩選出耐受14%酒精濃度，350mg/L SO2濃度，50%葡萄糖濃度和42℃高溫的優(yōu)良釀酒酵母耐受性相當(dāng)。因此最終選擇采用菌株a和d進(jìn)行發(fā)酵實驗。

表4 受試菌株對高濃度SO2耐受性測試結(jié)果Table 4 Results of tolerance test for strains by high concentration SO2

表5 受試菌株對高糖濃度耐受性測試結(jié)果Table 5 Results of tolerance test for strains by high concentration sugar

表6 受試菌株對高溫耐受性測試結(jié)果Table 6 Results of tolerance test for strains by high temperature

2.6 發(fā)酵實驗

用a、d兩種酵母菌進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵實驗，另接種丹寶利高效活性釀酒干酵母和VR5活性干酵母進(jìn)行對比實驗。發(fā)酵過程中葡萄酒比重的變化如表7所示。菌株的發(fā)酵理化實驗結(jié)果見表8。葡萄酒的感官鑒評結(jié)果見表9。

表7 各發(fā)酵罐中葡萄酒的比重變化Table 7 Changes of the proportion of wines in the fermentation tank

從表7中可知，一號發(fā)酵罐中a酵母菌發(fā)酵的葡萄酒在前四天的比重變化為0.021，較對應(yīng)二號0.009大，表示a菌株發(fā)酵速度比d快，發(fā)酵力強。兩種菌對應(yīng)發(fā)酵罐中葡萄酒的比重變化均與市售釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒比重變化相差不大。a菌株酵母菌發(fā)酵力較d菌株發(fā)酵力強，與市售酵母相當(dāng)。

優(yōu)良葡萄酒酵母應(yīng)具有生長速率快、耐高糖、耐SO2、發(fā)酵平穩(wěn)、酒精產(chǎn)率高、發(fā)酵完全等特性（本土葡萄酒）[9]。由表8可知，在發(fā)酵實驗中，菌株a和d的酒精產(chǎn)率較高，分別為7.8%和8.0%；還原糖殘留量低，分別為0.40、0.50g/L，其中a菌株發(fā)酵葡萄酒殘還原糖含量低于d菌株，說明a比d發(fā)酵完全，菌株a對葡萄的發(fā)酵性能比菌株d高；葡萄酒的總糖含量為2.6g/L，低于市售酵母菌，更易于保存，說明a，d兩菌株的發(fā)酵性能較好。葡萄酒干浸出物含量兩株菌均高于市售酵母菌，且a菌株高于d菌株，都顯著高于國標(biāo)中的18g/L；a、d菌株總酚含量高于市售菌株，其中菌株d最高為0.95mg/L，而總酚是影響葡萄酒的保健功能的主要成分[1，20]。另外，乙醇、揮發(fā)酸、總糖均在國家標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。

感官評定結(jié)果見表9，市售酵母菌發(fā)酵的葡萄酒的色、香、味各項指標(biāo)均良好，酒香濃郁、酒質(zhì)醇厚，而篩選出的2株酵母菌發(fā)酵后的香氣純正、香味濃郁，酒質(zhì)醇厚，符合國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 15037-2006）。菌株d發(fā)酵所得的葡萄酒色澤純正，透亮，香氣馥郁，但口感略差。菌株a發(fā)酵所得的葡萄酒色澤呈紅寶石色，口感濃郁幽香，香氣尤為突出，且風(fēng)味獨特。菌株a比菌株d發(fā)酵徹底，殘還原糖含量低，發(fā)酵迅速，葡萄酒風(fēng)味更佳，是所篩選菌株中優(yōu)良的菌株，可作為后續(xù)的實驗菌株。

表8 發(fā)酵理化實驗結(jié)果Table 8 Results of physical and chemical test in fermentation

表9 葡萄酒的感官鑒評結(jié)果Table 9 Results of sensory evaluation for wines

3 結(jié)論

從昌黎地區(qū)特色釀酒葡萄中篩選出4株酵母，進(jìn)行了菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)分離鑒定，其中菌株a和菌株d對酒精、SO2、糖、高溫的耐受性較b、c株菌株強。發(fā)酵性能結(jié)果表明菌株a的發(fā)酵力較菌株d強，發(fā)酵速度更快，且a菌株發(fā)酵所得葡萄酒的葡萄香氣尤為突出，風(fēng)味獨特，頗受鑒評者喜愛。菌株a是本研究所獲得的優(yōu)良菌株，可采用基因工程對其進(jìn)行進(jìn)一步改良，以期最終能應(yīng)用于昌黎地區(qū)特色葡萄酒的生產(chǎn)。

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Isolation and screening of Sacchamyces cerorevisiae from grape harvested in Changli

JIANG Wen-hong1，2，YAN Bin2，TAO Yong-sheng1，*
（1.College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.COFCO，Huaxia Greatwall wine Co.，Ltd.，Changli 066600，China）

Five species of yeast were isolated from Cabernet Sauvignon grapes cultivated in Changli County，and four were identified as Saccharomyces cerevisiae based on colony characteristics，cell morphology and Lysine Medium.Two Saccharomyces cerevisiae strains which could tolerate 14%alcohol concentration，concentration of 300mg/L SO2，glucose concentration 50%and 42℃ high temperature were selected via tolerance test.Compared with two Saccharomyces cerevisiae strains commercially available based on sensory evaluation and Physico-chemical analysis，selected strain“a”had the best fermentation most power，and the wine had the best taste with lowest volatile acids and 0.4g/L reducing sugar.So the selected strain“a”was the best Saccharomyces cerevisiae strain for Cabernet Sauvignon fermentation.

Changli；wine；Saccharomyces cerevisiae；strain screening；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.035

2014－01－03 *通訊聯(lián)系人

蔣文鴻（1980-），男，碩士研究生，工程師，主要從事葡萄酒釀造方面的研究。

國家十二五科技支撐計劃（2012BAD31B07）：優(yōu)質(zhì)果酒加工關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范項目。