謝貞建，唐遠(yuǎn)謀，王 超，張坤瓊，唐仁勇，王 衛(wèi)，*（.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都6006；.成都大學(xué)金牛校區(qū)管委會(huì)，四川成都6008；.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都6006）

酶解牦牛肉粉的制備工藝研究

謝貞建1，3，唐遠(yuǎn)謀2，王 超3，張坤瓊3，唐仁勇1，王 衛(wèi)1，3，*
（1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106；
2.成都大學(xué)金牛校區(qū)管委會(huì)，四川成都610083；3.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都610106）

目的：研究牦牛肉酶解工藝最佳參數(shù)，制備牦牛肉蛋白粉。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)牦牛肉酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：最佳酶解工藝為酶濃度1600IU/g、料液比1∶6（g∶mL）、pH9、溫度55℃，水解5h。在此條件下水解度達(dá)19.01%，水解液經(jīng)噴霧干燥得到香味濃郁的淺黃色粉末。結(jié)論：響應(yīng)面法確定的酶解條件合理，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值接近，該工藝條件可用于酶解牦牛肉粉的制備。

酶解，牦牛肉粉，水解度，響應(yīng)面設(shè)計(jì)

牦牛（Bos grunniens），是一種生活在青藏高原的長(zhǎng)毛的牛屬動(dòng)物，與北極熊、企鵝共稱為“世界三大高寒動(dòng)物”，具有極強(qiáng)的抗逆力、抗病能力、耐受性和適應(yīng)性。我國是世界上擁有牦牛頭數(shù)最多的國家，約占全世界的90%[1]?！秴问洗呵铩份d“肉之美者，牦象之肉”，牦牛肉被譽(yù)為“牛肉之冠”，屬半野生天然綠色食品，富含蛋白質(zhì)和氨基酸，鐵、鈣等微量元素。目前人們對(duì)牦牛肉的利用還主要局限于制作牦牛肉干等肉制品，對(duì)其進(jìn)行深加工還亟待加強(qiáng)。

酶解動(dòng)物蛋白水解后生成許多小肽和氨基酸，有利于人體吸收，提高蛋白質(zhì)的生物利用率，而且小肽具有許多保健功能[2]，同時(shí)也是現(xiàn)代肉味香精制造的關(guān)鍵技術(shù)[3]。對(duì)于水解動(dòng)物蛋白制備高附加值生物產(chǎn)品一直受到研究工作者的關(guān)注。動(dòng)物蛋白水解通過美拉德反應(yīng)得到獨(dú)特的風(fēng)味，制造肉味香精是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[4]。近年來，利用動(dòng)物蛋白酶解制備活性多肽受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。對(duì)烏賊[5]、紫河車[6]、扇貝[7]、鯊魚、毛蝦[8]等動(dòng)物蛋白酶解液的研究顯示其具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基的功能。本文通過選擇合適的酶，對(duì)牦牛肉酶解工藝進(jìn)行研究，水解液經(jīng)噴霧干燥制得牦牛肉粉，為牦牛肉的深加工提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛肉 購于四川省阿壩州；木瓜蛋白酶（1000IU/mg，批號(hào)：126928）、堿性蛋白酶（100IU/mg，批號(hào)：12122） 如吉生物科技；酸性蛋白酶（50000IU/mg，批號(hào)：01-121） 北京奧博星生物；枯草桿菌蛋白酶（1500IU/mg，批號(hào)：M0036） kayon生物；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純；所用蒸餾水 無離子雙蒸餾水。

AA-6800原子吸收分光光度計(jì) 日本島津；分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；B-290噴霧干燥設(shè)備 瑞士BUCHI mini spray dryer；TH2-C恒溫振蕩器 江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；CT14D臺(tái)式離心機(jī) 天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛肉原料一般營養(yǎng)成分分析 水分采用GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法[9]；蛋白質(zhì)采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法[10]；脂肪采用GB/T 9695.7-2008《肉與肉制品總脂肪含量測(cè)定》索氏抽提法[11]；總糖采用GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量測(cè)定》中直接滴定法[12]；鐵、鋅的測(cè)定采用原子吸收分光光度法[13-14]。

1.2.2 酶解工藝 牦牛肉→清洗絞碎→勻漿→調(diào)節(jié)pH→加蛋白酶保溫酶解→90℃水浴10min滅酶→冷卻至室溫→3000r/min離心10min→噴霧干燥→酶解牦牛肉粉。

1.2.3 蛋白酶的選擇 選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶作為牦牛肉水解用酶，各酶用量均為1000IU/g原料，料液比1∶5（g∶mL），分別在pH6.0、10.0、3.0、7.5下55℃水解5h。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在pH=10，料液比1∶5（g∶mL），55℃水解5h條件下，測(cè)定加酶量分別為800、1000、1200、1600、2000、2400IU/g時(shí)的水解度以確定最佳酶濃度；

在pH=10，酶濃度2000IU/g，55℃水解5h條件下，測(cè)定料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g∶mL）下測(cè)定水解度以確定最佳料液比；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），pH=10，55℃條件下水解1、2、3、4、5、6h，分別測(cè)定水解度以確定最佳酶解時(shí)間；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），55℃條件下水解5h，分別測(cè)定pH為8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0時(shí)的水解度以確定最佳pH；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），pH=10條件下水解5h，分別測(cè)定45、50、55、60、65℃時(shí)的水解度，以確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取酶濃度、料液比、初始pH、反應(yīng)溫度四個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平編碼見表1，反應(yīng)時(shí)間定為5h。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factors and code levels of Box-Behnken experimental design

1.2.6 分析檢測(cè) 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：采用甲醛電位滴定法[15]。水解度公式如下：

式中：DH—水解度，%；h0—樣品總氮含量，g/100g； h1—水解前氨基酸態(tài)氮的含量，g/100g；h2—水解后氨基酸態(tài)氮的含量，g/100g。

1.2.7 噴霧干燥[16]將酶解液在3000r/min，10min條件下離心，取上清液。直接加熱濃縮到固形物含量在12.0%左右，進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)樣溫度為160℃，出口溫度為85℃，蒸發(fā)容量為1.0L/h（以H2O計(jì)）。制備出干燥的酶解牦牛肉粉，用保鮮袋包裝，密封好，冷凍保藏。

1.3 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立皆由Design-expert（version 7.0.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA）輔助完成。圖表制作由GraphPad Prism 5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肉原料一般成分分析

牦牛肉的一般營養(yǎng)成分見表2，由表2可以看出，牦牛肉粗蛋白含量高達(dá)23.4%，脂肪和總糖含量較低。鐵含量較高，達(dá)34.5mg/kg，這可能跟牦牛為適應(yīng)高海拔缺氧的生活環(huán)境有關(guān)，體內(nèi)含有大量含F(xiàn)e肌紅蛋白以貯存O2。鋅是人體必需的微量元素之一，在體內(nèi)具有多種生理功能，人體每日所需鋅含量為12～16mg[17]，牦牛肉含鋅達(dá)39.7mg/kg，是良好的鋅補(bǔ)充來源。綜上，牦牛肉是一類高蛋白、低脂肪、低糖，富含鐵、鋅等微量元素的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白原料，符合現(xiàn)代營養(yǎng)健康理念。

表2 牦牛肉原料一般營養(yǎng)成分Table 2 The common nutritional ingredient of yak meat raw material

2.2 水解蛋白酶的選擇

酶解結(jié)果表明（圖1），堿性蛋白酶的水解效果最好，水解度達(dá)到13.02%，確定用堿性蛋白酶作為水解用酶。

圖1 水解蛋白酶的選擇Fig.1 The selection of proteinase

2.3 單因素酶解條件的選擇

2.3.1 酶濃度的選擇 由圖2可以看出，隨著酶濃度的增加水解度呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到2000IU/g后有下降趨勢(shì)。表明在2000IU/g的酶用量將可切割肽鍵基本酶解完畢，繼續(xù)增加酶用量并不能顯著提高水解度。

圖2 酶濃度對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.2 料液比的選擇 由圖3可以看出料液比在1∶5（g∶mL）的時(shí)候水解度明顯高于其他比例，此比例下牛肉漿流動(dòng)性好，利于酶與底物的充分結(jié)合。

圖3 料液比對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of ratio of substrate to water on degree of hydrolysis

2.3.3 水解時(shí)間的選擇 由圖4可以看出，隨著時(shí)間的增加，水解度逐漸增大，水解至5h時(shí)增長(zhǎng)緩慢。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of time on degree of hydrolysis

2.3.4 pH的選擇 由圖5可以看出，pH對(duì)酶的影響是很大的，當(dāng)pH=10時(shí)，水解度較高。

2.3.5 反應(yīng)溫度的選擇 由圖6可以發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)反應(yīng)的影響很大，50℃以后隨著溫度的上升，水解度有明顯下降的趨勢(shì)，酶蛋白結(jié)構(gòu)和活性可能受到破壞，導(dǎo)致水解度下降，50℃為該體系最適宜溫度。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析

圖5 pH值對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of pH value on degree of hydrolysis

圖6 溫度對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on degree of hydrolysis

相較于單因素實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)可以通過較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，有效建立連續(xù)變量與指標(biāo)之間的關(guān)系，同時(shí)可以考察單獨(dú)變量、變量相互之間的影響[18-19]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，修正得到水解度（Y）對(duì)酶濃度（A）、料液比（B）、pH（C）和溫度（D）的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=14.22+0.093A+0.70B+0.51C+0.17D-0.70CD+ 1.34A2+1.35B2+0.97C2+1.21D2。

模型的方差分析見表4，由表4可知，回歸模型的F=19.10，p＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)F=4.86，p=0.0685＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，表明本實(shí)驗(yàn)無其他因素的顯著影響，所選的模型是適合的。決定系數(shù)R2=0.9005，表明實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度，模型能夠很好地對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。校正決定系數(shù)R2adj=0.8533，說明該模型能說明85.33%的響應(yīng)值[20-21]。離散系數(shù)（CV）表示實(shí)驗(yàn)的精確度，其值越大，精確度越低，本實(shí)驗(yàn)CV=2.84%，在可接受范圍，該模型可用于堿性蛋白酶水解牦牛肉水解度的分析與預(yù)測(cè)。

從表4可知，一次項(xiàng)B極顯著、C高度顯著，其余兩項(xiàng)不顯著；交互項(xiàng)CD項(xiàng)高度顯著；所有的二次項(xiàng)均極顯著。由F值可知4個(gè)因素對(duì)水解度影響大小依次為：B＞C＞D＞A，即料液比＞pH＞溫度＞酶濃度。

回歸模型中交互項(xiàng)CD的等高線圖如圖7所示，此等高線圖呈橢圓形，表明初始pH（C）與反應(yīng)溫度（D）之間交互效應(yīng)顯著[22]。沿pH軸向變化等高線變化密集，說明pH對(duì)水解度的影響比溫度的影響顯著，水解度對(duì)pH的變化比對(duì)溫度的變化敏感。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及結(jié)果Table 3 Factors，levels and results of Response Surface Method（RSM）analysis

通過模型方程及響應(yīng)面的分析，優(yōu)化得到最佳酶解工藝為：酶濃度1600IU/g、料液比1∶6、pH9、溫度55℃，水解5h，預(yù)測(cè)在此條件下水解度達(dá)20.1%。經(jīng)三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得水解度的平均值為19.01%。水解液經(jīng)噴霧干燥，得淺黃色粉末。

圖7 溫度與pH交互作用對(duì)牦牛肉水解度影響的等高線圖Fig.7 Contour plot to study the effect of temperature and pH value on the degree of hydrolysis

表4 響應(yīng)面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface model

3 結(jié)論與討論

3.1 牦牛肉原料的一般營養(yǎng)成分：牦牛肉含水分73.5%、脂肪3.8%、蛋白質(zhì)23.4%、總糖0.02g/kg、鐵34.5mg/kg、鋅39.7mg/kg，是一種高蛋白、低脂肪、低糖，富含鐵、鋅等微量元素的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白。

3.2 在單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)牦牛肉酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立關(guān)于水解度與酶濃度、料液比、pH、溫度四個(gè)因素的回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型可行。4個(gè)因素對(duì)水解度影響大小依次為：料液比＞pH＞溫度＞酶濃度。最佳酶解工藝為：酶濃度1600IU/g、料液比1∶6（g∶mL）、pH9、溫度55℃，水解5h，在此條件下，水解度為19.01%。

3.3 在最佳酶解工藝條件下水解后，水解液經(jīng)噴霧干燥得香味濃郁的淺黃色粉末，蛋白質(zhì)被分解為小分子多肽或游離氨基酸，有利于人體吸收。本文為牦牛肉資源深加工提供了新的思路。

[1]《中國畜禽遺傳資源狀況》編委會(huì).中國畜禽遺傳資源狀況[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：18.

[2]張惠恩，金祥，王江強(qiáng).花蛤酶解工藝的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2012（10）：37-39.

[3]孫寶國.肉味香精的制造理念與核心技術(shù)[J].中國食品學(xué)報(bào)，2007，7（5）：1-5.

[4]宋煥祿，廖國洪.動(dòng)物蛋白酶解研究（Ι）[J].食品科學(xué)，2001，22（5）：21-26.

[5]RAJAPAKSEN，MENDISE，BYUNH G，et al.Purification and in vitro anti-oxidative effects of giant squidmusclepeptides on free radical-mediated oxidative systems[J].Nutr Biochem，2005，16（9）：562-569.

[6]TOGASH I S I，TAKAHASH IN，IWAMA M，et al.Antioxidative collagen-derived pep tides in human-placenta extract[J].

Placenta，2002，23（6）：497-502.

[7]曾慶祝，許慶陵，林魯萍.扇貝邊酶解物抗氧化作用研究[J].中國生化藥物雜志，2005，26（2）：86-89.

[8]吳繼衛(wèi)，何海倫，路敬濤.海洋生物蛋白的酶解及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[J].海洋科學(xué)，2005，29（3）：76-80.

[9]GB 5009.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定[S].

[10]GB 5009.5-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[11]GB/T 9695.7-2008肉與肉制品總脂肪含量測(cè)定[S].

[12]GB/T 9695.31-2008肉制品總糖含量測(cè)定[S].

[13]GB/T 9695.3-2009肉與肉制品鐵含量測(cè)定[S].

[14]GB/T 9695.20-2008肉與肉制品鋅的測(cè)定[S].

[15]遲原龍，文振華，崔敏，等.膠原水解度的測(cè)定[J].中國皮革，2010，39（19）：13-16.

[16]潘兆廣，陳中，林偉鋒，等.雞肉抗疲勞蛋白肽粉的制備研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（5）：494-497.

[17]Anon G.Report on revised standard for metals in food. Appendix IV[M].Common Wealth Government Printer，1979：60.

[18]SHIEH C，CHANG S W.Optimized synthesis of lipasecatalyzed hexyl acetate in n-hexane by response surface methodology[J].J Agric Food Chem，2001，49（3）：1203-1207.

[19]KIM B H，AKOH C C.Modeling and optimization of lipasecatalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic acid by response surface methodology[J].Food Chem，2007，102（1）：336-342.

[20]FORDE A，F(xiàn)ITZGERALD G F.Biotechnological approaches to the understanding and improvement of mature cheese flavor[J]. Current Opinion in Biotechnology，2000，11（5）：484-489.

[21]ADHIKARIK，HEYMANNH，HUFFH.Textural characteristics of low fat，full fat and smoked cheeses：sensory and instrumental approaches[J].Food Quality and Preference，2003，14（3）：211-218.

Study on preparation of enzymatic hydrolysis Yak meat powder

XIE Zhen-jian1，3，TANG Yuan-mou2，WANG Chao3，ZHANG Kun-qiong3，TANG Ren-yong1，WANG Wei1，3，*
（1.Meat Processing Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610106，China；2.Jinniu District Governing Board of Chengdu University，Chengdu 610083，China；3.Faculty of Biotechnology Industry of Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Object：To study the optimal conditions of enzymatic hydrolysis Yak meat and prepare the Yak meat powder.Methods：The optimal ranges of independent variables were selected on the basis of single-factor tests.Response surface methodology was adopted to evaluate the effects of reaction variables on the degree of hydrolysis.Results：The results showed that the optimal conditions for enzymatic hydrolysis were enzyme dosage 1600IU/g，the ratio of substrate to water 1∶6（g∶mL），the pH value 9，the reaction temperature 55℃，and reaction time of 5h.The actual degree of hydrolysis was 19.01%.The Yak meat powder was light yellow with the technology of spray drying.Conclusion：The obtained model was credible and could be used for the preparation of enzymatic hydrolysis Yak meat powder.

enzymatic hydrolysis；yak meat powder；degree of hydrolysis；response surface design

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0188-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.032

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

謝貞建（1982-），男，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（13-R12）；成都大學(xué)2013年校青年基金項(xiàng)目（2013XJZ13）；成都大學(xué)2013年創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（CDU_CX_201301137）；成都大學(xué)2013年科創(chuàng)杯實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2013-KC-ZRKX-24）。