周 冉，常 明，王 飛，孫耀冉，胡瑞省，張 煒（.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊050035；2.河北工業(yè)大學(xué)材料學(xué)院，天津30030）

仿生硅化-磁性Fe3O4固定化木瓜蛋白酶的性質(zhì)

周 冉1，常 明1，王 飛1，孫耀冉1，胡瑞省1，張 煒2，*
（1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊050035；2.河北工業(yè)大學(xué)材料學(xué)院，天津300130）

將木瓜蛋白酶（papain）交聯(lián)固定在經(jīng)氨基修飾過的磁性粒子上，通過papain誘導(dǎo)仿生硅化使磁性粒子（MNPS）表面包覆一層氧化硅，并將papain同時(shí)包埋于其中，制備出磁性氧化鐵（Fe3O4）-氧化硅載體。紅外光譜儀的測(cè)定表明，仿生硅化作用所形成的氧化硅能很好地包覆在磁性粒子交聯(lián)酶（EMNPS）表面。當(dāng)酶濃度為7.5mg·mL-1時(shí)，酶的載入量為0.24mg papain·mg-1MNPS，此時(shí)EMNPS和EMNPS/SiO2的活性分別3.72和3.66U·mg-1MNPS。EMNPS/SiO2的pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、重復(fù)操作穩(wěn)定性均優(yōu)于EMNPS。與游離papain相比，EMNPS與底物的親和力略有升高，而EMNPS/SiO2與底物的親和力降低。EMNPS和EMNPS/SiO2的米氏常數(shù)Km分別為1.39、2.31mg·mL-1，最大反應(yīng)速度Vm分別為0.04、0.038mg·mL-1·min-1。

仿生硅化，氧化硅，木瓜蛋白酶，磁性氧化鐵，固定化

木瓜蛋白酶（papain，PA）大量存在于番木瓜的未成熟果實(shí)中，是一種含巰基（-SH）的肽鏈內(nèi)切酶，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等具有強(qiáng)的水解能力，因而被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)、食品、美容、制革等方面[1-2]。雖然木瓜蛋白酶具有催化能力強(qiáng)，作用底物專一，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但穩(wěn)定性差，容易變性失活，而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中與底物反應(yīng)，難以回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅成本較高，而且難以連續(xù)化生產(chǎn)。因此，對(duì)酶的固定化將能有效降低酶的可溶性從而解決以上問題。

近年來，仿生方法固定化酶一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，以生物模板仿生合成的納米氧化硅載體為固定化酶提供了新技術(shù)[3-8]。但是由于采用仿生硅化法制備的氧化硅載體多為納米級(jí)，雖然有利于傳質(zhì)，但會(huì)給后期固定化酶的分離造成困難。而磁性納米粒子由于超順磁性質(zhì)，常常被用于生物分離和固定化酶載體等領(lǐng)域。另外，磁性粒子毒副作用小，易于進(jìn)行修飾，可通過表面修飾連接上功能基團(tuán)，從而可進(jìn)行磁性顆粒與生物活性物質(zhì)（如蛋白、DNA）的偶聯(lián)，一方面保證這些生物活性物質(zhì)可在反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)一步識(shí)別相應(yīng)的特異性物質(zhì)，另一方面依靠磁性顆粒的獨(dú)特性能，利用磁場(chǎng)對(duì)顆粒的操縱性，達(dá)到易分離的目的。目前關(guān)于酶自誘導(dǎo)仿生固定化酶的研究相對(duì)較少，沒有系統(tǒng)的分析酶的活性和穩(wěn)定性的報(bào)道。

本文以木瓜蛋白酶為誘導(dǎo)劑，在其誘導(dǎo)催化生成納米氧化硅的同時(shí)將其自身包埋于氧化硅顆粒之中，形成固定化木瓜蛋白酶。并在仿生硅化固定化酶的基礎(chǔ)上，引入磁性Fe3O4載體，選用硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對(duì)Fe3O4納米粒子表面進(jìn)行氨基化修飾，再與木瓜蛋白酶進(jìn)行交聯(lián)，將磁性粒子與木瓜蛋白酶相結(jié)合共包埋于氧化硅中，實(shí)現(xiàn)磁性載體與仿生硅化在固定化酶應(yīng)用上的有效結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木瓜蛋白酶（papain，400U·mg-1） Genview公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 北京市申達(dá)精細(xì)化工有限公司，分析純；FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、三氯乙酸、聚乙二醇（PEG）、氨水 天津市江天化工技術(shù)有限公司，分析純；酪蛋白（干酪素） 天津福晨化學(xué)試劑廠，分析純；L-酪氨酸 Sigma公司，BR；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 北京市申達(dá)精細(xì)化工有限公司，分析純。

Nexu-870型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；JY96-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波市新芝科技研究所；SHA-B型恒溫水浴振蕩器 天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QT6150型超聲波清洗機(jī) 天津市瑞譜電子儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性載體的制備

1.2.1.1 磁性粒子（MNPS）的制備 采用共沉淀法制備Fe3O4粒子：在250mL三頸圓底燒瓶中分別加入2.5g FeCl3·6H2O，1g FeCl2·4H2O和100mL蒸餾水，在N2保護(hù)下，加入1.8g聚乙二醇（PEG），快速攪拌并加入8mL氨水，控制反應(yīng)液pH為9.4～9.5，25℃溫水浴18min，再升溫至70℃熟化30min，反應(yīng)液以磁鐵分離并取沉淀，每次用50mL蒸餾水清洗，至無明顯氨味，真空干燥備用。

1.2.1.2 氨基化磁性粒子（NH2-MNPS）的制備 將以上MNPS溶于150mL乙醇/水（體積比1∶1）溶液中，超聲制得Fe3O4懸濁液。將Fe3O4懸濁液轉(zhuǎn)入250mL三頸圓底燒瓶中，N2保護(hù)下，攪拌，加入0.4mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），40℃，攪拌1h后冷卻至室溫，磁鐵收集沉淀，并用50mL乙醇洗滌，蒸餾水洗滌3次，真空干燥，可得NH2-MNPS，即磁性載體。

1.2.2 固定化酶的制備

1.2.2.1 磁性載體交聯(lián)酶（EMNPS）的制備 取10mg NH2-MNPS于離心管中，加入1.5mL，5mg·mL-1木瓜蛋白酶（用pH7.0、0.1mol·L-1PBS配制），200r/min，30℃恒溫振蕩，孵化20min后，使得游離酶吸附于磁性粒子上，然后加入1%戊二醛1.5mL，于30℃，200r/min振蕩下，孵化30min。磁分離，取固定化酶，分別用Tris-HCl（pH8.0，0.1mol·L-1）洗滌一次，PBS（pH8.0，0.1mol·L-1）洗滌2次，磁分離得交聯(lián)上木瓜蛋白酶的磁性粒子，即EMNPS。

1.2.2.2 EMNPS表面包覆SiO2（EMNPS/SiO2）的制備 應(yīng)用木瓜蛋白酶自誘導(dǎo)仿生硅化原理[9]，在EMNPS外包裹一層SiO2，得到EMNPS/SiO2，以防止酶的脫落。具體步驟：取上述制得的EMNPS，加入1.5mL pH6.6的PBS，再加入0.1mL硅前驅(qū)體溶液，反應(yīng)15min，磁分離取沉淀，得EMNPS/SiO2。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酶的表征和性質(zhì)測(cè)定 固定化酶和游離酶粉末分別在紅外燈照射下和干燥的KBr粉末一起研細(xì)混勻，壓片后用Nexu-870型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)其FT-IR譜。固定化酶的最佳反應(yīng)溫度、最佳反應(yīng)pH和米氏Km值參照文獻(xiàn)[10]測(cè)定。

1.3.2 木瓜蛋白酶的活性測(cè)定 取制得的固定化酶，加入6mL磷酸緩沖溶液（pH7.0），酪蛋白溶液6mL（已恒溫），開始記時(shí)，40℃水浴振蕩，并開始記時(shí)，反應(yīng)30min。加入6mL、20%的三氯乙酸溶液，強(qiáng)力振搖混勻，終止反應(yīng)，繼續(xù)在水浴中靜置20min使蛋白完全沉淀，離心取上清液，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)273nm下測(cè)其吸光度。在測(cè)定條件下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸所需的木瓜蛋白酶的量為一個(gè)酶活單位（U）。相對(duì)酶活為各處理?xiàng)l件下的各酶活與其最大酶活的比值。

1.3.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 木瓜蛋白酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，通過米氏方程（見式1）的雙倒數(shù)形式，即Lineweaver-Burke plot（見式2），來測(cè)定酶促反應(yīng)中的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

式中，V0為反應(yīng)初速度（mg·mL-1·min-1）；[S]為底物濃度（mg·mL-1）。V0通過papain催化不同濃度酪蛋白為底物的反應(yīng)來測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶濃度對(duì)固定化效果的影響

初始固定化酶濃度既影響單位質(zhì)量固定化酶中酶分子含量，又會(huì)影響到固定化酶的形成，從而影響固定化酶的酶活。因此，酶濃度對(duì)酶載入量、EMNPS和EMNPS/SiO2活性的影響如表1所示。

表1 不同酶濃度下固定化酶載入量和酶活Table 1 Loading and activity of the immobilized enzyme under different initial enzyme concentration

由表1可以看出，當(dāng)酶濃度較低時(shí)，固定化酶載入量和活性均呈升高趨勢(shì)，而當(dāng)酶濃度繼續(xù)增加時(shí)，酶的載入量基本無變化，但酶活略有下降。這主要是因?yàn)閷?duì)于一定量的磁性載體，加入的酶量已經(jīng)達(dá)到飽和，過量的酶無法被固定于載體上，且酶濃度太高易使酶分子發(fā)生團(tuán)聚，從而使得酶活有所降低。而EMNPS/SiO2的活性比EMNPS有所降低，可能是因?yàn)樵诎惭趸璧倪^程中，一部分交聯(lián)不牢固的酶分子脫落和氧化硅對(duì)酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)阻力作用的影響。因此，在酶濃度為7.5mg·mL-1時(shí)固定化效果較好。

2.2 載體及固定化酶的表征結(jié)果

2.2.1 磁性載體的照片 圖1為磁性載體被磁鐵吸引的照片，由圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)制得的磁性粒子具有較好的磁性，易于后續(xù)反應(yīng)過程中對(duì)固定化酶的分離。

圖1 磁性粒子被磁鐵吸引的照片F(xiàn)ig.1 Photos of different samples dispersed in water

2.2.2 紅外譜圖分析 通過紅外光譜中磁性載體和固定化酶相關(guān)特征基團(tuán)的變化，分析制得載體和固定化酶的性質(zhì)和機(jī)理，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 樣品紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of sample

圖3 樣品紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of sample

圖2是Fe3O4納米粒子氨基功能化前后的紅外譜圖。由圖2可以看出，NH2-Fe3O4載體存在位于3424cm-1附近的強(qiáng)吸收峰，這可能是N-H伸縮振動(dòng)與-OH的伸縮振動(dòng)峰發(fā)生了重疊；2923cm-1和2853cm-1處出現(xiàn)的CH2及C-H伸縮振動(dòng)峰，較未修飾的Fe3O4強(qiáng)度有所增加，這主要來自于APTES中含有的大量-CH2；Fe-O鍵的伸縮振動(dòng)峰位于580cm-1，與未修飾的Fe3O4相比，修飾后的磁性載體Fe-O吸收峰發(fā)生藍(lán)移。這主要是由于APTES與Fe3O4粒子表面發(fā)生反應(yīng)形成Fe-O-Si鍵，與Fe3O4表面的Fe-O-H相比，Si原子比H原子有更強(qiáng)的電負(fù)性，通過靜電誘導(dǎo)作用，增加了Fe-O的鍵力常數(shù)，使Fe-O基團(tuán)頻率向高波數(shù)移動(dòng)。由以上分析可得，F(xiàn)e3O4納米粒子表面成功修飾上了氨基功能基團(tuán)。由圖3可見，譜線c為木瓜蛋白酶的紅外光譜，其中有6個(gè)特征吸收峰：3418cm-1處為N-H伸縮峰，峰帶較寬；2934cm-1處為C-H伸縮峰；1650cm-1波數(shù)左右為酰胺Ⅰ帶，C=O伸縮峰，峰帶較窄；1500cm-1波數(shù)左右為酰胺Ⅱ帶，N-H彎曲峰；1450～1250cm-1波數(shù)為酰胺Ⅲ帶，C-H伸展振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)的混合峰；1062cm-1波數(shù)左右為C-O伸縮峰。另與圖2中的譜線b對(duì)比，圖3中的譜線b在1000cm-1處出現(xiàn)的寬峰，說明木瓜蛋白酶已被固定在載體之上。與譜線b比較，譜線a在1100cm-1附近的吸收峰增強(qiáng)且變尖，這主要是由于樣品a表面包覆有由仿生硅化作用所形成的氧化硅，其中的Si-O-Si的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1100cm-1處，使得該處吸收峰的形態(tài)發(fā)生變化。

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2在室溫（25℃）下儲(chǔ)存33d，儲(chǔ)存穩(wěn)定性結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，包裹有氧化硅的EMNPS/SiO2在經(jīng)過33d的儲(chǔ)存后相對(duì)酶活保持在75%以上。而只是交聯(lián)固定化的EMNPS，相對(duì)活性降到了30%以下。在儲(chǔ)存10d內(nèi)，兩種固定化酶的穩(wěn)定性均好于游離酶，說明木瓜蛋白酶經(jīng)過固定化抑制了自降解，提高了穩(wěn)定性。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，EMNPS的酶活快速降低，而EMNPS/SiO2仍保持很高的活性，原因是，包裹的氧化硅層的微孔結(jié)構(gòu)，能有效阻止微生物進(jìn)入微孔內(nèi)部降解酶，從而使EMNPS/SiO2酶活性在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)得以保持。

圖4 游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.4 Storage stability of free enzyme，EMNPS and EMNPS/SiO2

2.3.2 pH穩(wěn)定性 在pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，三種形態(tài)的酶被置于不同pH的緩沖溶液中，預(yù)先孵化4h，然后測(cè)定木瓜蛋白酶的活性。游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2在pH3.0～10.0條件下儲(chǔ)存的相對(duì)活性，如圖5所示。三種形態(tài)酶的pH穩(wěn)定性由高到低依次為：EMNPS/SiO2、EMNPS、游離酶。實(shí)際上，酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵，而氫鍵是由酶分子中一個(gè)氨基酸殘基上的氫原子與另一個(gè)氨基酸殘基上的氧原子通過靜電引力而形成的，所以外界pH的改變將對(duì)氫鍵產(chǎn)生顯著的影響，從而影響酶的空間構(gòu)象，影響酶的活性。EMNPS/SiO2的氧化硅微孔的籠效應(yīng)可有效束縛木瓜蛋白酶，避免酶分子內(nèi)部氫鍵受到極端pH條件的影響而發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，使得酶的活性得到保持。

圖5 游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of free enzyme，EMNPS and EMNPS/SiO2

2.3.3 溫度穩(wěn)定性 游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2在溫度30～90℃條件下儲(chǔ)存時(shí)的相對(duì)酶活，如圖6所示。與游離酶相比，EMNPS和EMNPS/SiO2均具有良好的溫度穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)陀?0℃時(shí)EMNPS的溫度穩(wěn)定性最好。這是因?yàn)?，通過交聯(lián)固定化后的酶與載體通過交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)了多點(diǎn)連接，溫度升高時(shí)，可防止酶分子發(fā)生伸展變形，同時(shí)，酶活力也可以實(shí)現(xiàn)緩慢釋放。而溫度繼續(xù)升高，EMNPS/SiO2穩(wěn)定性優(yōu)于EMNPS，原因是經(jīng)由氧化硅包覆后，酶被緊緊束縛在一定的空間內(nèi)，在受熱時(shí)也很難發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，酶活得以保持。這可稱為籠效應(yīng)，類似于酶分子在天然細(xì)胞中的空間排斥效應(yīng)。另外，木瓜蛋白酶分子在氧化硅微孔中受到束縛，其表面水分子層結(jié)構(gòu)難以破壞，也有效地抑制了酶分子變性失活，從而提高了酶的溫度穩(wěn)定性。

圖6 游離酶、EMNPS和EMNPS/SiO2熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of free enzyme，EMNPS and EMNPS/SiO2

2.3.4 EMNPS和EMNPS/SiO2的重復(fù)使用穩(wěn)定性 如圖7所示，經(jīng)過5次重復(fù)使用，EMNPS/SiO2的相對(duì)活性仍在60%以上，而EMNPS的相對(duì)活性已降到20%以下。結(jié)果說明EMNPS/SiO2的使用穩(wěn)定性要優(yōu)于EMNPS。EMNPS為表面交聯(lián)固定化酶，在反應(yīng)過程中易出現(xiàn)酶脫落的問題，此外，大量對(duì)酶分子有抑制作用的反應(yīng)底物和水分子都會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響；EMNPS/SiO2固定化酶在原有的交聯(lián)酶外層包裹氧化硅，而這層氧化硅在反應(yīng)中能有效防止酶分子的流失，且反應(yīng)底物要通過氧化硅的空隙與酶分子接觸，不會(huì)造成大量底物對(duì)酶活性結(jié)構(gòu)的損害，對(duì)酶分子起到一定的保護(hù)作用。因此，EMNPS/SiO2固定化酶的使用穩(wěn)定性要比EMNPS好。

圖7 EMNPS和EMNPS/SiO2的重復(fù)使用性Fig.7 Reusability of the EMNPS and EMNPS/SiO2

2.3.5 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 為了進(jìn)一步探討木瓜蛋白酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，通過米氏方程（見式1）的雙倒數(shù)形式，即Lineweaver-Burke plot（見式2），來測(cè)定酶促反應(yīng)中的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。將1/V0對(duì)1/[S]作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對(duì)值，如表2所示。

表2 游離酶和固定化酶的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Michaelis constant（Km）and maximum velocity（Vmax）of free and immobilized enzyme

結(jié)果表明，與游離酶的1.52mg·mL-1比較，EMNPS的Km值降低至1.39mg·mL-1，說明磁性載體交聯(lián)固定化酶與底物之間的親和力略有升高。而經(jīng)過包覆氧化硅后，Km值升高，其原因可能是包裹的氧化硅對(duì)酶造成立體阻礙，使底物較不容易與酶的催化中心接觸，導(dǎo)致包裹有氧化硅的固定化酶與底物的親和力降低。三種形態(tài)的酶的Vmax變化不大，說明固定化對(duì)酶的Vmax影響較小。

3 結(jié)論

將木瓜蛋白酶交聯(lián)固定在氨基修飾過的磁性粒子上，通過木瓜蛋白酶誘導(dǎo)使磁性粒子（MNPS）表面包覆一層氧化硅，并同時(shí)將其包埋于其中，可實(shí)現(xiàn)溫和固定化和高效分離的有效結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)磁載體最大載酶量為0.24mg papain·mg-1MNPS，此時(shí)EMNPS和交聯(lián)酶后包覆氧化硅（EMNPS/SiO2）的活性分別3.72、3.66U·mg-1MNPS。由于氧化硅提供了適宜的微環(huán)境，不僅固定化酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有明顯提高，而且可借助外加磁場(chǎng)方便快速地回收，提高酶的重復(fù)使用性，降低成本。因此，采用仿生法能夠制備出良好的磁性Fe3O4-氧化硅載體，不僅為固定化酶技術(shù)提供了新的方法，而且進(jìn)一步拓展了仿生礦化的應(yīng)用。

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Property of papain immobilized on magnetic ferroferric oxide by biosilicification

ZHOU Ran1，CHANG Ming1，WANG Fei1，SUN Yao-ran1，HU Rui-sheng1，ZHANG Wei2，*
（1.School of Chemical Engineering，Shijiazhuang University，Shijiazhuang 050035，China；2.School of Materials Science and Engineering，Hebei University of Technology，Tianjin 300130，China）

An approach combining biomimetic mineralization with Fe3O4magnetic particles（MNPS）was proposed to prepare immobilized papain that was easily separated from reaction mixture.The results from FT-IR spectra showed that aminosilane-modified MNPS was synthesized，and EMNPS was coated with biosilica by biomimetic silicification.When the concentrate of papain was 7.5mg·mL-1，the loading of papain was 0.24mg·mg-1MNPS and the activity of EMNPS and EMNPS/SiO2were 3.72 and 3.66U·mg-1MNPS，respectively.Furthermore，the pH stability，thermal stability and reusability of EMNPS/SiO2were better than EMNPS.Compared with free papain，EMNPS has slightly higher affinity，and EMNPS/SiO2has lower affinity with substrate.The Michaelis constant（Km）for hydrolysis of casein by EMNPS and EMNPS/SiO2were 1.39 and 2.31mg·mL-1.The maximum velocity（Vm）of EMNPS and EMNPS/SiO2were 0.04 and 0.038mg·mL-1·min-1，respectively.

biosilicification；silica；papain；magnetic ferroferric oxide；immobilization

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.030

2013－09－10 *通訊聯(lián)系人

周冉（1981-），女，博士，講師，研究方向：藥物載體與藥物制劑。

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（12272701）；國家自然科學(xué)基金（51102075）。