翟清燕，趙龍玉，趙鳳春，楊正友（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系，農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化酶乳酸菌的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

翟清燕，趙龍玉，趙鳳春，楊正友*
（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系，農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量，以此為指標(biāo)，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品分離篩選的100株乳酸菌中，選出一株發(fā)酵后游離型大豆異黃酮產(chǎn)量最高的作為生產(chǎn)功能性發(fā)酵豆乳的發(fā)酵菌株。經(jīng)生理生化及遺傳學(xué)特性鑒定該菌株為植物乳桿菌。并通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)影響游離型大豆異黃酮產(chǎn)量的3個(gè)發(fā)酵因素，即發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量，進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度45℃、發(fā)酵時(shí)間17h、接種量5%，在此條件下游離型異黃酮的產(chǎn)量為132.814μg/mL。

發(fā)酵豆乳，游離型大豆異黃酮，植物乳桿菌，發(fā)酵優(yōu)化

大豆是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的植物蛋白資源，富含人體必需的氨基酸和脂肪酸，以及人體生理代謝過(guò)程中所需的多種生物活性物質(zhì)，如大豆異黃酮（Iso）、低聚糖、降壓肽、γ-氨基丁酸等。其中大豆異黃酮是大豆在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種次生代謝產(chǎn)物，含量約為0.1%～0.5%[1]，由于其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物雌激素相似，素有植物雌激素的美稱(chēng)，而且具有類(lèi)似雌激素的生理功能，如抗腫瘤、緩解更年期癥狀、降血壓、降血脂和心血管疾病發(fā)病率等[2-3]。

目前已研究發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，包括3種游離型苷元結(jié)構(gòu)（大豆苷元，染料木素，大豆黃素，占2%～3%）和9種結(jié)合型糖苷結(jié)構(gòu)（占97%～98%）[4]。研究表明，大豆異黃酮苷元型的生物活性比其相應(yīng)糖苷要高，能夠直接被小腸上皮細(xì)胞吸收，是人體可以利用的有效形式，但90%以上的大豆異黃酮均以糖苷形式存在，因此，天然大豆及其產(chǎn)品中大豆異黃酮的生物活性一般比較低。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒋蠖巩慄S酮結(jié)構(gòu)中的β-O-糖苷鍵水解使糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元形式，從而提高大豆制品中異黃酮的生物有效性。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物以及一些酵母、霉菌和細(xì)菌體內(nèi)，一些研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌中普遍含有β-葡萄糖苷酶，而且乳酸菌作為人體的腸道益生菌可以直接添加到食品中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵β-葡萄糖苷酶將異黃酮糖苷結(jié)構(gòu)水解，轉(zhuǎn)化成的苷元形式可以直接被小腸吸收，有效促進(jìn)異黃酮生物功能的發(fā)揮[5]。本研究力圖篩選高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化酶的益生菌來(lái)發(fā)酵豆乳，提高游離型大豆異黃酮的產(chǎn)量，結(jié)合大豆和乳酸菌的雙重保健作用，研制出一種風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)兼具的功能性發(fā)酵豆乳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；乳酸菌100株 保存于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；大豆苷（Daidzin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木苷（Genistin）、染料木素（Genistein）標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于Aladdin公司；甲醇、冰乙酸 色譜純；水 去離子水。

高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司；COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ（150mm×4.6mm） 日本Nacalai Tesque公司；超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；高速冷凍離心機(jī)Effendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵豆乳的制備[6]大豆（無(wú)霉?fàn)€、變質(zhì)）→清洗浸泡→磨漿→過(guò)濾→煮漿→分裝→殺菌（95℃，15min）→冷卻（42℃）→接種→培養(yǎng)。

1.2.2 高產(chǎn)糖苷轉(zhuǎn)化酶乳酸菌的篩選

1.2.2.1 大豆異黃酮的提取[7]發(fā)酵豆乳1mL與25mL 100%甲醇混合均勻，并置于超聲波中于50℃萃取40min，待超聲波萃取結(jié)束后離心（8000r/min，30min），取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后，將剩余液體轉(zhuǎn)移到離心管中用甲醇定容至5mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，將濾液進(jìn)高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定不同菌株發(fā)酵后游離型大豆異黃酮的含量，由此來(lái)確定最佳發(fā)酵菌株。

1.2.2.2 高效液相色譜條件 采用C18色譜柱（150mm× 4.6mm，4.5nm）；流動(dòng)相：水相（0.1%冰醋酸）：有機(jī)相甲醇（0.1%冰醋酸）（5.5∶4.5）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫。

1.2.2.3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 根據(jù)上述色譜條件，將大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素四種標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.001、0.005、0.01、0.03、0.1mg/mL 5個(gè)濃度梯度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出大豆苷的回歸方程為：y=107x-15334，R2=0.9992；大豆苷元的回歸方程為：y=5×107x-20013，R2=0.999；染料木苷的回歸方程為：y=107x+5105，R2=0.9993；染料木素的回歸方程為：y= 6×107x-25716，R2=0.999。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定[8]。

1.2.3.2 遺傳學(xué)鑒定[9-10]16S rDNA序列擴(kuò)增和分析：采用CTAB法提取DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后與pMD18-T載體連接，將載體轉(zhuǎn)化到E·coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選提取重組質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得序列提交到GenBank中進(jìn)行序列對(duì)比，并用MEGA 3.1軟件以Neighbor Join法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)[11]

1.2.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)大豆異黃酮含量的影響 取活化好的菌液按2%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，分別置于27、32、37、42、47℃的溫度條件下培養(yǎng)8h，分析不同溫度對(duì)大豆異黃酮含量的影響。

1.2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆異黃酮的影響 取活化好的菌液按2%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，置于37℃條件下分別發(fā)酵0、4、8、12、16、20、24h，觀察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量的影響。

1.2.4.3 接種量對(duì)大豆異黃酮的影響 取活化好的菌液按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，置于37℃條件下發(fā)酵8h，觀察不同接種量對(duì)發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮含量的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)自變量選取低、中、高3個(gè)實(shí)驗(yàn)水平分別以箒1、0、1進(jìn)行編碼（見(jiàn)表1），利用Design Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到多元二次回歸方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，從而確定最佳發(fā)酵條件。

該模型的多元二次回歸方程可以表達(dá)為：

其中Y為響應(yīng)值（游離型大豆異黃酮總量），A0，Ai，Aii，Aij為方程系數(shù)，Xi，Xj（i≠j）為自變量編碼值。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The coded and uncoded values of variables in Box-Behnken design

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本文測(cè)定的數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Excle進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)糖苷轉(zhuǎn)化酶乳酸菌的篩選

將不同菌株按一定比例接入豆乳中，測(cè)定發(fā)酵后各樣品中大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素的含量，篩選出一株發(fā)酵后游離型大豆異黃酮（即大豆苷元和染料木素）總量最高的作為發(fā)酵菌株，并以原豆?jié){中各成分的含量作為對(duì)照（見(jiàn)表2），可知該菌株發(fā)酵后豆乳中游離型大豆異黃酮的總量大約是未發(fā)酵的8倍。大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見(jiàn)圖1，原豆?jié){液相色譜圖見(jiàn)圖2，發(fā)酵后的液相色譜圖見(jiàn)圖3。

表2 原豆乳和發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮的濃度（μg/mL）Table 2 Concentration of soy isoflavone of soybean milk and fermented soymilk（μg/mL）

2.2 菌株鑒定

2.2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定[13]通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量的測(cè)定，獲得一株高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化酶乳酸菌，將其命名為L(zhǎng)P4。通過(guò)顯微鏡觀察鑒定LP4為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，菌落形態(tài)特征為圓形，表面光滑，呈乳白色，不透明，生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of HPLC of soy isoflavone standard

圖2 原豆乳高效液相色譜圖Fig.2 The chromatogram of soybean milk

圖3 發(fā)酵豆乳高效液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of fermented soybean milk

2.2.2 16S rDNA基因序列及遺傳學(xué)分析[14]測(cè)序得知菌株LP4的16S rDNA基因序列含有1438bp，其GenBank登錄號(hào)為KF192886。將LP4菌株的16S rDNA基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Lactobacillus屬成員具有較高的序列相似性，用Neighbor Joining方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）表明其與Lactobacillus plantarum種親緣關(guān)系密切，序列相似性達(dá)到了99%。因此，根據(jù)菌株LP4的形態(tài)特征和16S rDNA基因序列以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將菌株LP4初步鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 菌株LP4及相關(guān)細(xì)菌16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain LP4 and related strains

2.3 游離型大豆異黃酮發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)大豆異黃酮含量的影響 由圖5可知，游離型大豆異黃酮（大豆苷元和染料木素）的含量隨著溫度的升高逐漸增大，相反，糖苷型大豆異黃酮（大豆苷和染料木苷）的含量隨之減少。當(dāng)溫度為42℃時(shí)游離型大豆異黃酮總量達(dá)到最大，溫度繼續(xù)升高，游離型大豆異黃酮的含量反而降低。這可能由于過(guò)高的溫度已不適宜菌體的生長(zhǎng)，β-葡萄糖苷酶的活性下降，糖苷型結(jié)構(gòu)不能再轉(zhuǎn)化為游離型結(jié)構(gòu)。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)大豆異黃酮含量的影響Fig.5 Effect of fermented temperature on soy isoflavone yield

表3 LP4菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiology biochemistry experiments of Lactobacillus plantarum 4

2.3.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量的影響 由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)糖苷型大豆異黃酮（大豆苷和染料木苷）不斷水解轉(zhuǎn)化為游離型大豆異黃酮，在發(fā)酵初期，游離型大豆異黃酮的增加量較為顯著，12h以后增長(zhǎng)開(kāi)始變緩，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因推測(cè)是發(fā)酵后期菌株進(jìn)入生長(zhǎng)衰退期，發(fā)酵活力有所下降，β-葡萄糖苷酶的活性也因此降低。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆異黃酮含量的影響Fig.6 Effect of fermented time on soy isoflavone yield

2.3.1.3 接種量對(duì)大豆異黃酮含量的影響 由圖7可知，當(dāng)接種量較小時(shí)，豆乳中游離型大豆異黃酮的含量隨著接種量的增加而升高，而接入的菌液過(guò)多時(shí)，游離型大豆異黃酮的量反而降低，這可能是由于接種量過(guò)高，菌體在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的乳酸等酸性物質(zhì)，在低pH環(huán)境下會(huì)影響糖苷型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為游離型結(jié)構(gòu)，而且強(qiáng)酸環(huán)境還可能會(huì)造成游離型結(jié)構(gòu)的水解，因此，確定4%～6%為適宜的接種范圍。

圖7 接種量對(duì)大豆異黃酮含量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on soy isoflavone yield

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳發(fā)酵條件

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）為自變量，游離型大豆異黃酮總量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，回歸方程方差分析表見(jiàn)表5。

利用Design Expert軟件對(duì)表4中游離型大豆異黃酮總量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得游離型大豆異黃酮總量對(duì)編碼自變量發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=132.08+3.96A+3.43B+2.00C-1.24AB-0.15AC+ 0.76BC-3.20A2-5.20B2-5.79C2式（2）

模型方程回歸方差分析顯著性結(jié)果表明，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.9256），并且該模型的R2=0.9873，R2adj=0.9709，說(shuō)明回歸方程的擬合程度良好，可靠性高，自變量和響應(yīng)值之間的線(xiàn)性關(guān)系高度顯著，可以用于游離型大豆異黃酮含量的理論預(yù)測(cè)。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of Box-Behnken design

表5 回歸方程方差分析表Table 5 ANOVA for the evaluation of the quadratic model

由Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到游離型大豆異黃酮最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度44.81℃、發(fā)酵時(shí)間17.10h、接種量5.18%，在此條件下，游離型大豆異黃酮總量理論值可達(dá)133.845μg/mL。

2.4.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果作出相應(yīng)的3D圖，如圖8所示，當(dāng)接種量為固定為5%的條件下，發(fā)酵溫度為45℃，發(fā)酵時(shí)間為16h左右時(shí)，游離型大豆異黃酮的含量達(dá)到最大值，且發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用達(dá)到了顯著水平。根據(jù)Yang等[15]對(duì)Pseudomonas ZD-8菌株中β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)45℃時(shí)其活性可以保持穩(wěn)定，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，活性降低到原來(lái)的44%，與本研究所得結(jié)論基本一致。由圖9可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間固定在16h的條件下，發(fā)酵溫度與接種量對(duì)游離型大豆異黃酮的影響均很顯著，選擇一個(gè)適合乳酸菌生長(zhǎng)的溫度及提高接種量可增加游離型大豆異黃酮的產(chǎn)量。同時(shí)，結(jié)合圖10和表5可以看出當(dāng)發(fā)酵溫度固定在42℃時(shí)，接種量與發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離型大豆異黃酮產(chǎn)量的影響顯著，且發(fā)酵時(shí)間影響的顯著性要大于接種量。微生物發(fā)酵可以發(fā)揮β-葡萄糖苷酶的作用，使異黃酮糖苷型結(jié)構(gòu)向生物活性更高的游離型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的生長(zhǎng)速率減慢，β-葡萄糖苷酶的活性也隨之下降。

2.4.3 模型的驗(yàn)證 考慮到操作的方便性，將最佳條件調(diào)整為：發(fā)酵溫度45℃，發(fā)酵時(shí)間17h，接種量5%，在此條件下，測(cè)得的游離型大豆異黃酮總量為132.814μg/mL，稍低于預(yù)測(cè)值133.649μg/mL，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值較為吻合，說(shuō)明該模型可以較好的反映游離型大豆異黃酮的最佳發(fā)酵條件。

圖8 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.8 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different fermentation time and temperature

圖9 接種量與發(fā)酵溫度對(duì)游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.9 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different inoculation amount and fermentation temperature

圖10 接種量與發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.10 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different inoculation amount and fermentation time

3 結(jié)論

本研究通過(guò)HPLC法測(cè)定發(fā)酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量，從中篩選出一株高產(chǎn)大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化酶菌株作為生產(chǎn)功能性發(fā)酵豆乳的發(fā)酵菌株，經(jīng)生理生化及遺傳學(xué)特性鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。以游離型大豆異黃酮含量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，得出最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度45℃、發(fā)酵時(shí)間17h、接種量5%，在此條件下游離大豆異黃酮的含量可達(dá)到132.814μg/mL。本研究結(jié)果顯示利用該菌株發(fā)酵豆乳具備明顯的開(kāi)發(fā)潛力和優(yōu)勢(shì)，大大提高了大豆制品中異黃酮的生物有效性，為今后發(fā)酵豆制品的研發(fā)提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Isolation and identification of high-yield soy isoflavone glycosidase of lactic acid bacteria and optimization of fermentation conditions

ZHAI Qing-yan，ZHAO Long-yu，ZHAO Feng-chun，YANG Zheng-you*
（Department of Microbiology，College of Life Science，Key Laboratory for Agriculture Microbiology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

For production of functional fermented soymilk，one strain was selected from one hundred lactic acid bacteria isolates based on their capacities to hydrolyze isoflavone glucosides to aglycones by high performance liquid chromatography（HPLC）.Based on the biochemistry and genetic characteristics analysis，the strain was classified as Lactobacillus plantarum.Fermentation conditions including fermentation time，temperature and inoculum amount were optimized by one-factor-at-a-time and response surface methodology（RSM）.The optimum fermentation condition as follows：fermentation for 17h at 45℃with inoculation amount of 5%，while the soy isoflavone aglycones production was 132.814μg/mL.

fermented soymilk；soy isoflavone aglycones；Lactobacillus plantarum；fermentation optimization

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0162-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.026

2014－01－14 *通訊聯(lián)系人

翟清燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

國(guó)家自然科學(xué)基金（30972050，31271873）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2010CM015）。