徐　敏，李　晶，鄭志永，朱　莉，詹曉北，，*，李　珊，張洪濤（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無(wú)錫214125）

哈茨木霉產(chǎn)水解熱凝膠的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的分離純化

徐敏1，2，李晶1，2，鄭志永1，2，朱莉3，詹曉北1，2，3，*，李珊1，2，張洪濤1，2
（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無(wú)錫214125）

結(jié)合多種分離方法，從哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371）的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到一種對(duì)不溶性多糖熱凝膠具有較高水解活性的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶。結(jié)果表明，哈茨木霉發(fā)酵液經(jīng)50%飽和度硫酸銨沉淀預(yù)處理后，依次經(jīng)過HiPrep 26/10 desalting層析柱脫鹽、QFF陰離子交換層析柱去除雜質(zhì)蛋白，最終經(jīng)Superdex 75凝膠柱純化獲得純度較高的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶。最終酶活回收率為6.63%，內(nèi)切酶比酶活由6.86U/mg提高到133.01U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到19.39倍。MALDI-TOF-TOF鑒定結(jié)果表明，該內(nèi)切酶與產(chǎn)自綠色木霉的endoglucanase存在較高的同源性。

哈茨木霉，β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶，熱凝膠，分離純化

β-1，3-葡聚寡糖作為一類重要的生理活性物質(zhì)，其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大[1-2]。例如β-1，3-葡聚寡糖可以通過刺激宿主免疫功能、激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞而具有抗菌抗腫瘤活性[3-6]。目前水解具有β-1，3-糖苷鍵的葡多糖是制備β-1，3-葡聚寡糖的主要方法。而以專一性內(nèi)切酶降解多糖制備相應(yīng)寡糖具有水解條件溫和、操作簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.6或EC3.2.1.39）能夠沿分子鏈隨機(jī)切割β-1，3-糖苷鍵，釋放出小分子量寡糖（DP 2-10）。同時(shí)該類酶來(lái)源廣泛，植物、真菌以及細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)。因此，通過內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶降解β-1，3-葡聚糖獲取相應(yīng)寡糖是一種較為理想的方法。除此之外，β-1，3-葡聚糖酶在細(xì)胞融合和轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體制備、食品加工、藥物篩選、飼料工業(yè)和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)方面也有著巨大的潛在應(yīng)用[7]。

熱凝膠是一種由土壤桿菌（Agrobacterium sp.）合成的線性無(wú)支鏈胞外β-1，3-葡聚糖，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。因而熱凝膠可以作為安全的生產(chǎn)β-1，3-葡聚寡糖的原料。研究表明，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種β-1，3-葡聚糖酶[8-12]，但能夠利用熱凝膠作為水解底物的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶鮮有報(bào)道[13]。

本研究選取以熱凝膠為主要碳源的哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）發(fā)酵液，依次經(jīng)過硫酸銨沉淀預(yù)處理、分子篩層析除雜質(zhì)、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等操作，獲得了純度較高的具有顯著水解熱凝膠活性的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶。本研究可以為熱凝膠處理及內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶純化等工業(yè)放大問題提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）菌種由江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖15，酵母粉20，硫酸銨2.5，磷酸二氫鉀6，硫酸鎂0.8，氯化鈣1，pH6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 熱凝膠25，葡萄糖5，硝酸鈉9，胰蛋白胨1，磷酸二氫鉀20，七水硫酸鎂0.3，氯化鈣0.4，pH6.0；熱凝膠（Curdlan） 購(gòu)于Takeda-Kirin Food Co.（日本）；其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

Silica gel 60 F254層析板購(gòu)自Merck KGaA，（德國(guó)）；CS-9301PC雙波長(zhǎng)飛點(diǎn)掃描薄層分析儀Shimadzu Corp.，日本；JYSCZ2+凝膠電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；陰離子交換層析與體積排阻層析系統(tǒng)均采用?KTA AvantGE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典；層析柱為HiPrep 26/10 Desalting、HiTrap Q FF、Superdex 75 10/300 GL瑞典。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2內(nèi)切酶酶活的測(cè)定取一定量的酶液加入到0.5mL 10g/L的熱凝膠底物（25mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液配制）中，酶與底物質(zhì)量比為1∶200，用緩沖液補(bǔ)足體積，使得終反應(yīng)體積為1mL，50℃反應(yīng)3h，沸水浴煮沸10min終止反應(yīng)。寡糖含量（DP2-5）可由TLC薄層層析法[14]結(jié)合雙波長(zhǎng)飛點(diǎn)掃描儀進(jìn)行半定量檢測(cè)，精確定量根據(jù)HPLC利用Click Maltose柱分析寡糖含量。

將每小時(shí)催化水解熱凝膠后獲得1mg寡糖（DP2-5）所需酶的量定義為一個(gè)內(nèi)切酶酶活單位（U）。

1.2.3粗酶液的制備將哈茨木霉菌株以5%（v/v）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于25℃，105r/min振蕩培養(yǎng)6d。發(fā)酵結(jié)束后，首先經(jīng)8層紗布過濾發(fā)酵液得到濾液，然后濾液于8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。然后于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4硫酸銨沉淀粗分離蛋白緩慢加入一定量硫酸銨至設(shè)定飽和度，然后用稀H2SO4或氨水調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值，并于4℃靜置過夜使蛋白充分沉淀，然后處理液于4℃，8000×g離心15min。最后以去離子水復(fù)溶沉淀至一定濃度溶液，并于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的純化

1.2.5.1脫鹽柱層析取濃縮的粗酶液，以水作為流動(dòng)相，流速2.5mL/min，進(jìn)樣量為20mL，經(jīng)HiPrep 26/10 desalting層析柱脫鹽，除去小分子雜質(zhì)。

1.2.5.2陰離子交換層析采用?KTA Avant蛋白純化系統(tǒng)對(duì)脫鹽處理后的上述酶液進(jìn)行AEC分離。先以20mmol/L pH8.0的PBS緩沖液平衡層析住，流速為1mL/min。然后進(jìn)樣1mL，進(jìn)樣后先平衡兩個(gè)柱體積，再以1mol/L NaCl溶液進(jìn)行等度洗脫，收集每個(gè)峰測(cè)定酶活，將有酶活力的組分進(jìn)行凍干濃縮。

1.2.5.3體積排阻層析AEC洗脫得到的活性組分0.5mL上樣于G75凝膠過濾層析柱，洗脫液為含0.1mol/L NaCl的20mmol/L pH7.0的PBS緩沖液，流速為0.5mL/min，每1mL收集測(cè)定酶活，收集有酶活的組分，進(jìn)行超濾脫鹽，凍干濃縮。

1.2.6蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析及MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定使用不連續(xù)垂直電泳系統(tǒng)，對(duì)分離純化的β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶進(jìn)行分析。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳采用pH8.3的Tris-HCl緩沖體系。電泳后考馬斯亮蘭R250進(jìn)行染色分析。將純化出的單一蛋白條帶進(jìn)行切膠，MALDI-TOF-TOF鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1硫酸銨沉淀預(yù)處理哈茨木霉發(fā)酵液

2.1.1pH和溫度對(duì)硫酸銨沉淀效果的影響隨著溫度改變，一定飽和度的硫酸銨溶液中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)隨之改變，且發(fā)酵液中蛋白質(zhì)在不同pH條件下的電荷狀態(tài)存在差異，為此，首先考察了pH和溫度對(duì)硫酸銨沉淀效果的影響。

表1　pH對(duì)硫酸銨沉淀蛋白效果的影響Table 1　Effect of pH on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

表2　溫度對(duì)硫酸銨沉淀蛋白效果的影響Table 2　Effect of temperature on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

選擇20%飽和度的硫酸銨溶液，在pH5.3～8.3，4～25℃范圍內(nèi)，將哈茨木霉發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀后，對(duì)蛋白回收率、回收蛋白β-葡聚糖酶活力、水解產(chǎn)物中寡糖含量、寡糖占總糖比例等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果見表1和表2，在上述pH和溫度范圍內(nèi)，各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)間均無(wú)顯著差異。說(shuō)明在較溫和條件下（pH5.3～ 8.3，4～25℃），硫酸銨沉淀提取目標(biāo)蛋白（內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶）不受pH和溫度影響。

2.1.2硫酸銨飽和度對(duì)獲取目標(biāo)蛋白的影響哈茨木霉發(fā)酵液經(jīng)不同飽和度硫酸銨溶液沉淀后結(jié)果差異明顯（圖1）。由圖1可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為30%時(shí)，回收后蛋白表現(xiàn)出較高的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活性，熱凝膠水解液中寡糖濃度（DP 2-5）達(dá)到1.3g/L，在總糖中所占比例達(dá)到最高，為74%。當(dāng)硫酸銨飽和度提高至40%時(shí)，水解液中寡糖含量明顯降低，而單糖所占比例增加到幾乎50%。隨著硫酸銨飽和度的進(jìn)一步升高，熱凝膠水解液中總糖濃度逐漸下降，可能原因是雜質(zhì)蛋白在較高硫酸銨飽和度時(shí)逐漸析出，降低了目標(biāo)蛋白在蛋白沉淀中所占的比例（圖2，蛋白回收率隨著硫酸銨飽和度提高顯著增加）。由此可見，低硫酸銨飽和度有利于內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活性的富集。

圖1　不同硫酸銨飽和度沉淀蛋白水解熱凝膠得到的寡糖分析Fig.1　Results of degrading curdlan to oligosaccharide by different ammonium sulfate saturation on protein extraction

圖2　不同硫酸銨飽和度沉淀所得到的蛋白酶活分析Fig.2　Influence of ammonium sulfate saturation on enzyme activity

盡管降低硫酸銨飽和度對(duì)目標(biāo)蛋白提取有利，但是蛋白回收率和總酶活回收率均明顯偏低（圖2）。綜合考慮總酶活回收率、比酶活提高倍數(shù)、大規(guī)模生產(chǎn)的操作成本等幾方面因素，選擇硫酸銨飽和度為50%較為適宜。在此條件下，總酶活回收率達(dá)到63.42%，內(nèi)切酶比酶活比發(fā)酵液提高33%。

2.2陰離子交換與分子篩層析結(jié)合純化內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶

2.2.1雜質(zhì)組分的初步去除哈茨木霉發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀處理后，復(fù)溶樣品中含有的無(wú)機(jī)鹽及多肽等雜質(zhì)會(huì)對(duì)后續(xù)分離產(chǎn)生干擾，因此首先采用分子篩層析方法對(duì)復(fù)溶蛋白樣品進(jìn)行初步純化。選擇HiPrep 26/10 desalting色譜柱（MWCO=5000u），以去離子水為洗脫劑，流速2.50mL/min時(shí)的樣品洗脫曲線見圖3。測(cè)定結(jié)果表明，在該分離條件下，蛋白組分（圖3，P1）與雜質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)了較好的分離，P1組分可用于后續(xù)純化操作。

圖3　HiPrep 26/10 desalting脫鹽柱脫鹽曲線Fig.3　Chromatography of protein by HiPrep 26/10 desalting

2.2.2內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的純化隨后，采用離子交換層析方法對(duì)除去雜質(zhì)的蛋白組分（圖3，P1）進(jìn)一步純化，條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在pH8.0時(shí)，采用陰離子交換層析柱對(duì)目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)了較好的分離。圖4為采用HiTrap Q FF陰離子交換層析柱獲得的洗脫曲線，按峰收集組分。經(jīng)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，水解熱凝膠活性集中在P1區(qū)域（穿透峰），P2區(qū)域（吸附蛋白峰）未檢測(cè)到水解活性。表明目標(biāo)蛋白未與層析填料產(chǎn)生吸附作用，此時(shí)穿透峰與吸附蛋白峰明顯分離，且無(wú)機(jī)鹽濃度較低，有利于后續(xù)操作進(jìn)行，同時(shí)，較為簡(jiǎn)便的階段洗脫方法更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化放大。

圖4　HiTrap Q FF陰離子交換洗脫曲線Fig.4　Chromatography of protein by HiTrap Q FF

然后，采用分子篩層析方法對(duì)目標(biāo)蛋白峰（圖4，P1）進(jìn)一步純化。選擇Superdex 75 10/300 GL色譜柱，經(jīng)條件優(yōu)化后得到了較為理想的分離效果（圖5，圖6）。經(jīng)蛋白濃度測(cè)定，洗脫后蛋白集中在峰1～4（圖5），其余均為非蛋白峰。然后，采用薄層層析法（TLC）對(duì)峰1～4水解熱凝膠產(chǎn)物進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，峰2（11～13mL）表現(xiàn)出外切酶活性，峰4（15～ 17mL）表現(xiàn)出了明顯的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶活性（圖6，Lane 3）。由于內(nèi)切酶是隨機(jī)切割β-1，3糖苷鍵，因此水解得到的并不都是寡糖，有少量的單糖。

圖5　Superdex 75 10/300 GL凝膠柱洗脫曲線Fig.5　Chromatography of protein by Superdex 75 10/300 GL

圖6　不同純化階段蛋白樣品水解熱凝膠產(chǎn)物的TLC鑒定圖譜Fig.6　TLC analysis of curdlan hydrolyzates by protein samples at different purification steps

圖7　內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶純化過程SDS-PAGE圖譜Fig.7　SDS-PAGE results of proteins during the purification of endo-β-1,3-glucanase

圖7為內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶分離各步驟的SDSPAGE電泳圖譜。由圖7可知，經(jīng)過硫酸銨沉淀預(yù)處理、分子篩層析除雜質(zhì)、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等一系列操作后，最終獲得了單一條帶的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶產(chǎn)品（MW=73.6ku）。最終蛋白回收率為6.63%，比酶活達(dá)到133.01U/mg，純化19.39倍（表3）。為獲得電泳純度較高的蛋白，分子篩層析只收集了峰4的峰尖2mL，因此最終酶活回收率偏低。

2.2.3純化后內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的鑒定為進(jìn)一步考察純化后內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的性質(zhì)，采用MALDI-TOF-TOF二級(jí)質(zhì)譜對(duì)純化后蛋白序列進(jìn)行了分析。通過與NCBI non-redundant protein sequences中的已知蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)自綠色木霉（Trichoderma virens）中的endoglucanase（GenBank no. ABO93399.2）存在較高的同源性，匹配分值為181分。該蛋白分子量81ku，等電點(diǎn)6.4，均與本研究純化得到的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶接近。

圖8　純化后內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶與endoglucanase（GenBank no.ABO93399.2）序列比對(duì)結(jié)果Fig.8　Sequence alignment between the purified endo-β-1，3-glucanase and endoglucanase（from Trichoderma virens，GenBank no.ABO93399.2）

3　結(jié)論

本研究建立了從哈茨木霉（T.harzianum Rifai ACCC30371）發(fā)酵液中獲取可以降解熱凝膠的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的純化方法，并且結(jié)合定量薄層層析法以水解液中寡糖濃度代替總糖濃度用以評(píng)價(jià)內(nèi)切酶活性。結(jié)果表明，發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨沉淀預(yù)處理、分子篩層析除雜質(zhì)、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等操作后，最終獲得了純度較高的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶。經(jīng)測(cè)定，內(nèi)切酶分子量73.6ku，最終純化19.39倍。該蛋白與產(chǎn)自綠色木霉（Trichoderma virens）的endoglucanase蛋白具有較高的同源性。

表3　內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶純化數(shù)據(jù)匯總Table 3　Summary of purification of the endo-β-1，3-glucanase from T.harzianum Rifai ACCC30371

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Purification of an endo-β-1，3-glucanase to degrade curdlan from Trichoderma harzianum

XU Min1，2，LI Jing1，2，ZHENG Zhi-yong1，2，ZHU Li3，ZHAN Xiao-bei1，2，3，*，LI Shan1，2，ZHANG Hong-tao1，2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

In combination with a variety of purification methods，an endo-β-1，3-glucanase was separated from Trichoderma harzianum fermentation broth，which had high hydrolysis activity to insoluble polysaccharide curdlan.The purification process was carried out sequentially as follows，50%ammonium sulfate precipitation from cell culture supernate，HiPrep 26/10 desalting gel chromatography，removing impurities protein by QFF anion exchange column，finally was purified by Superdex 75 gel chromatography.The enzyme activity yield was 6.63%.The purification scheme resulted in an increase in the specific activity（from 6.86 to 133.01U/mg）and a 19.39-fold purification of endo-β-1，3-glucanase relative to the crude broth.Identified by MALDITOF-TOF，the result showed that the purified enzyme had high homology with the endoglucanase from Trichoderma virens.

Trichoderma harzianum；endo-β-1，3-glucanase；curdlan；purification

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.025

2013－11－07*通訊聯(lián)系人

徐敏（1988-），女，碩士研究生，研究方向：蛋白純化與功能性寡糖制備。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31171640，31201384，31271888）；無(wú)錫市科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）（CLE01N1208）；無(wú)錫市生物農(nóng)業(yè)領(lǐng)軍型創(chuàng)業(yè)人才計(jì)劃（“130”計(jì)劃）。