劉江輝，劉金盾，劉利娥，袁 軍（.福建農林大學生命科學學院，福建福州5000；.鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州45000；.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南鄭州45000）

芝麻葉多酚的純化及對蛋白質非酶糖基化的抑制作用

劉江輝1，劉金盾2，劉利娥3，袁 軍1
（1.福建農林大學生命科學學院，福建福州350002；2.鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001；3.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南鄭州450001）

從D101、AB-8、NKA-9、S-8、ADS-5大孔吸附樹脂中通過靜態(tài)實驗篩選出AB-8樹脂，研究其對芝麻葉粗提物中多酚的靜態(tài)吸附和解吸性能，并通過單因素實驗確定AB-8樹脂柱的最佳純化工藝條件；然后，考察了芝麻葉多酚對體外蛋白質非酶糖基化終末產物（AGEs）生成的抑制作用。結果表明：AB-8大孔吸附樹脂對芝麻葉多酚粗提物具有較好的分離純化效果；AB-8樹脂柱對芝麻葉多酚粗提物的最佳純化條件為：上柱液體積12mL，上柱液濃度3.5mg/mL，pH5.0，洗脫體積為3BV（柱體積），依次以30%（v/v）和50%（v/v）乙醇溶液進行梯度洗脫，多酚純度從16.88%分別提高到28.43%和45.71%，純化產物分別命名為SPP1和SPP2。芝麻葉多酚粗提物、SPP1、SPP2對蛋白質非酶糖基化終產物的生成具有明顯的抑制作用，抑制效果均優(yōu)于陽性對照品氨基胍。

芝麻葉，多酚，純化，蛋白質非酶糖基化終產物

芝麻屬脂麻科，一年生草本植物，是我國最重要的油料作物之一。芝麻葉是芝麻生產的伴生物，產量大于芝麻的產量，資源極其豐富。芝麻葉中富含鉀、鈣、磷、鐵等礦質元素、不飽和脂肪酸、氨基酸及多酚等，是一種口味鮮美的食品新資源[1]。植物多酚是植物體內重要的次生代謝產物，是一類分子結構中含多個酚羥基的化合物。植物多酚具有多種生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗菌和抗病毒、抗腫瘤、預防心腦血管疾病、增強免疫以及美白和減肥等，受到了人們的普遍關注[2-3]。然而，采用有機溶劑法提取的多酚粗提物，常常含有一些糖類、果膠及蛋白質等雜質，這些雜質的存在對多酚的品質影響很大，既不利于保存，也不利于其成分分析和活性利用。因此，為提高芝麻葉提取物的利用價值，需要對粗提物進行純化。大孔吸附樹脂具有選擇性好、吸附容量大、再生處理方便等諸多優(yōu)點而廣泛應用于天然產物的分離純化[4-5]。因此，用大孔吸附樹脂純化芝麻葉粗提物對芝麻葉多酚的保存和利用具有重要意義。

蛋白質非酶糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）是指還原糖與蛋白質、脂質或核酸的氨基基團發(fā)生非酶促反應形成的一類復雜的不可逆聚合物[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實，AGEs能改變蛋白質的結構和功能、影響脂質代謝、修飾核酸及誘導氧化應激，是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的主要因素[7]。如AGEs在體內積蓄誘發(fā)動脈硬化、白內障、糖尿病性腎病以及心肺順應性減低等[8-9]。這些糖尿病并發(fā)癥是導致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。因此篩選開發(fā)抑制AGEs形成的食品或藥物，對于預防和治療糖尿病并發(fā)癥有重要意義。迄今為止，關于芝麻葉抗AGEs形成的研究鮮有報道。本文對芝麻葉多酚粗提物的純化工藝及其抗AGEs形成的抑制活性進行研究，為芝麻葉的深度開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻葉 購于河南省駐馬店平輿縣；Folin-Ciocalteu試劑制備 參照文獻[10]；鹽酸氨基胍（Fluka Chemie Gmbh，Stenheim，Germany）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京鼎國生物技術有限責任公司；D-葡萄糖 Sigma-Aldrich公司；沒食子酸、無水乙醇、鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、硫代巴比妥酸等 均為分析純，購自國藥集團；D101、AB-8、NKA-9、S-8、ADS-5大孔吸附樹脂 天津歐瑞生物科技有限公司。

UV-1601紫外可見分光光度計 日本島津；RE2000旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；AY-120分析天平 日本島津；TDL-4離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市丹瑞電器廠；pHs-3C酸度計 上海雷磁儀器廠；BT100蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法進行測定[11]，以沒食子酸為標準品測定多酚的濃度。測定的標準曲線回歸方程為：A=0.1103C+0.0095，R2=0.9981，C為多酚質量濃度（mg/L），A為吸光度。

1.2.2 樣品液制備 芝麻葉→清洗→干燥→粉碎→過60目篩→脫脂（正己烷為溶劑，索氏提取法[12]）→70%（v/v）乙醇浸提（液料比50mL/g，微波功率420W，微波時間120s）→離心（4000r/min，20min）→上清液（旋轉蒸發(fā)，濃縮，冷凍干燥）→芝麻葉多酚粗提物（Raw polyphenols）。

1.2.3 樹脂純化工藝 芝麻葉多酚粗提液→上大孔吸附樹脂柱→水洗→乙醇梯度解吸→解吸液（旋轉蒸發(fā)，冷凍干燥）→芝麻葉多酚純化產物（SPP1，SPP2）。

1.2.4 樹脂靜態(tài)吸附與解吸實驗 準確量取40.0mL一定濃度的芝麻葉多酚粗提物水溶液于100mL錐形瓶中，分別加入1g經處理的大孔吸附樹脂（ADS-5、D101、AB-8、S-8、NKA-9）。在30℃恒溫振蕩器中以130r/min恒溫振蕩24h，取出錐形瓶，采用300目不銹鋼濾網過濾，測定濾液中未被吸附的多酚濃度。將負載多酚的樹脂轉入100mL錐形瓶中，并用40.0mL 70%（v/v）乙醇少量多次沖洗濾網，保證所有樹脂進入瓶內。于相同條件下解吸，取一定量解吸液測其多酚含量，并按下面的公式計算各種樹脂的吸附量、吸附率及解吸率，以比較不同樹脂對芝麻葉多酚的吸附和解吸特性。計算公式為：

q=Vo（Co-Ce）/m 式（1）

Ads（%）=（Co-Ce）/Co×100 式（2）

Des（%）=CdesVdes/（Co-Ce）Vo×100 式（3）

式中：Co—原料液中多酚濃度（mg/L）；Ce—吸附平衡時溶液中多酚濃度（mg/L）；Cdes—洗脫液中多酚濃度（mg/L）；Vo—原料液體積（mL）；Vdes—洗脫液體積（mL）；q—單位樹脂吸附多酚的飽和吸附量（mg/g）；Ads—多酚吸附率（%）；Des—多酚解吸率（%）。

1.2.5 動態(tài)吸附與解吸實驗

1.2.5.1 上樣液體積的影響 將50.0mL篩選出的大孔樹脂采用濕法裝柱，裝入內徑為1.5cm、柱長40.0cm的層析柱中，純水洗滌平衡后上樣。初始上樣液濃度為2.0mg/mL，用恒流泵以1.0mL/min的流速進樣，上樣液體積分別為4、8、12、16、20mL，吸附平衡2h。吸附平衡后，用1BV（柱體積）的水淋洗樹脂柱，再用3BV 70%（v/v）乙醇洗脫，洗脫流速2.0mL/min。收集洗脫液，測定芝麻葉多酚的濃度，計算多酚的回收率。

1.2.5.2 上樣液pH的影響 上樣條件：最佳上樣液體積由1.2.5.1確定，上柱液pH分別為2、3、4、5、6、7。測定洗脫液多酚濃度，計算多酚回收率。

1.2.5.3 上樣液濃度的影響 上樣條件：最佳上樣液體積由1.2.5.1確定，最佳上柱液pH由1.2.5.2確定，上柱液濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL。測定洗脫液多酚濃度，計算多酚回收率。

1.2.5.4 洗脫液乙醇體積分數(shù)的影響 上樣條件：最佳上樣液體積由1.2.5.1確定，最佳上柱液pH由1.2.5.2確定，上柱液濃度由1.2.5.3確定，洗脫液乙醇濃度分別為10%、30%、50%、70%、95%（v/v）。測定洗脫液多酚濃度，計算多酚回收率。多酚回收率計算公式：

式中：Cdes、C0分別為洗脫液和原料液中多酚濃度（mg/mL）；Vdes、V0分別為洗脫液和原料液進樣體積（mL）；R為多酚回收率（%）。

1.2.5.5 洗脫曲線 按上述所確定的最佳條件上樣和洗脫，每10.0mL收集一份洗脫液，測定洗脫液中多酚濃度，以洗脫液體積為橫坐標（mL），洗脫液中多酚濃度（mg/L）為縱坐標，繪制洗脫曲線，確定洗脫終點。

1.2.6 芝麻葉多酚的純化 在1.5cm×40.0cm吸附柱優(yōu)化出實驗條件的基礎上，使用容量更大的柱子（4.0cm×60.0cm）進行實驗?？疾煲来斡眉兯?0%、50%、70%、95%（v/v）乙醇為洗脫劑時，用等強度洗脫和梯度洗脫的方式得到純化部位中多酚的純度。多酚純度計算公式：

式中：X為純化部位中多酚的質量分數(shù)（%）；m為洗脫物的質量（mg）；Vdes為洗脫液體積（mL）；Cdes為洗脫液中多酚濃度（mg/mL）。

取500mL AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱（4.0cm× 60.0cm），自然沉降12h。用1BV水沖洗柱子。準確稱取3.0g芝麻葉多酚粗提物，用適量純水溶解，蠕動泵以1.0mL/min流速把樣品溶液加到柱子頂端，平衡4h。流動相以3.0mL/min的流速，用1BV水洗，依次用3BV 30%、50%、70%、95%（v/v）乙醇洗脫，分別收集洗脫液。將洗脫液旋轉蒸發(fā)，濃縮至浸膏，冷凍干燥，分別得到不同體積分數(shù)的乙醇洗脫物。按照同樣的方法，分別用30%、50%、70%、95%（v/v）乙醇為洗脫劑進行等強度洗脫，洗脫液的處理方法同梯度洗脫，分別得到不同乙醇體積分數(shù)的等強度洗脫物。

1.2.8 蛋白質非酶糖基化實驗 采用牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）反應體系模型[13]，實驗分組見表1。用新煮沸又冷卻的純水分別配制25.0、75.0、150mg/L的氨基胍和芝麻葉多酚溶液，并配制pH7.4的磷酸鹽緩沖液，用緩沖液配制20.0mg/L的牛血清白蛋白（用0.22μm濾膜除菌）、0.5mol/L葡萄糖溶液；按表1所示將相應溶液加入到50mL無菌培養(yǎng)瓶中，反應瓶置于55℃培養(yǎng)箱，孵育42h。孵育到設定時間時，取0.3mL糖基化反應溶液，稀釋至3.0mL，測定AGEs在激發(fā)波長370nm、發(fā)射波長440nm處的熒光強度F。根據模型組、樣品組、樣品空白組的熒光強度計算芝麻葉多酚對BSA非酶糖基化的抑制率（Inhibition rate，IR）。

式中：Fblank為空白組，F(xiàn)model為模型組，F(xiàn)sample為樣品組，IR為抑制率（%）。

表1 體外BSA非酶糖基化實驗分組Table 1 List spot of protein non-enzyme glycation assay method in vitro

2 結果與討論

2.1 大孔吸附樹脂純化芝麻葉多酚實驗結果

樹脂靜態(tài)吸附與解吸性能比較 表2列出了五種大孔樹脂對芝麻葉多酚的靜態(tài)吸附和解吸性能。由表2可知，非極性的D101型和弱極性的AB-8型大孔樹脂的富集效果較好。這可能是芝麻葉多酚結構中含有部分酚羥基而具有一定的極性，在吸附過程中容易形成氫鍵吸附；同時在解吸過程中，氫鍵吸附極易被強極性的低碳醇類洗脫劑破壞，所以洗脫也相對容易，解吸率也較高。綜合評價其對芝麻葉多酚的吸附與解吸性能，確定AB-8型大孔樹脂作為分離純化芝麻葉多酚的最佳樹脂。

2.2 大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸實驗

2.2.1 原料液體積的影響 原料液進樣體積對多酚回收率的影響，結果見圖1。由圖1顯示，進樣液體積較低時，多酚回收率隨進樣體積的增加而增大，當進樣液體積由4.0mL增加到12.0mL時，多酚回收率由39.25%增加到87.44%；隨后多酚回收率隨進樣體積增加緩慢下降。這是由于進樣液體積增加，導致穿透點提前，多酚回收率下降。因此，原料液進樣體積控制在12.0mL左右較合適。

圖1 上樣液體積對樹脂吸附性能的影響Fig.1 Effect of sample volume on polyphenols recovery rate

表2 大孔樹脂的結構性能參數(shù)及靜態(tài)吸附-解吸結果Table 2 Physical characters of macroporous resins and results of static adsorption and desorption

2.2.2 原料液pH的影響 在原料液體積為12.0mL時，考察原料液pH的影響，結果如圖2所示，在pH為4.0、5.0、6.0時，多酚回收率分別為86.19%、94.72%和87.12%。這是由于多酚類化合物的結構中具有多羥基酚結構或糖苷鍵，故呈弱酸性，因此在弱酸性條件下能達到較好的吸附效果，由此得出，進樣液pH控制在5.0較為合適。由于芝麻葉多酚粗提液的pH在5.0附近，所以，實驗均用芝麻葉多酚粗提液直接上樣。

圖2 上樣液pH對樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of sample pH on polyphenols recovery rate

2.2.3 原料液濃度的影響 原料液濃度對大孔吸附樹脂純化多酚的回收率的影響見圖3。由圖3所示，當多酚粗提物濃度較低時，多酚回收率隨多酚濃度的增加而增大，當上樣液濃度達到3.5mg/mL時，多酚回收率達到最大91.71%；隨后多酚回收率隨著多酚濃度上升而下降。這是由于原料液濃度過高，導致穿透點提前，多酚回收率下降。因此，選擇上樣溶液濃度為3.5mg/mL。

圖3 上樣液濃度對樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of sample concentration on polyphenol recovery rate

2.2.4 洗脫劑乙醇濃度的影響 在原料液體積為12mL，濃度為3.5mg/mL的條件下，考察乙醇體積分數(shù)對多酚回收率的影響，結果如圖4所示，乙醇體積分數(shù)由10%增大到50%（v/v）時，多酚回收率由24.04%增大到91.71%；繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，多酚回收率開始緩慢下降，因此選擇50%乙醇作為最佳洗脫劑。

2.2.5 解吸曲線分析 以50%（v/v）乙醇為洗脫劑，洗脫曲線見圖5。

圖5顯示，大孔樹脂上吸附的多酚類物質隨著洗脫劑的不斷洗脫，逐漸流出分離柱。當洗脫體積為50～80mL時，洗脫液中的芝麻葉多酚濃度較高。繼續(xù)用洗脫液洗脫，洗脫液中多酚濃度降低，當洗脫液體積為150mL時，150mL處洗脫液中多酚濃度已經趨于零，而所用大孔樹脂柱體積為50.0mL，因此用3BV（柱體積）的洗脫劑可將多酚類物質完全洗脫。

圖4 乙醇體積分數(shù)對樹脂洗脫效果的影響Fig.4 Effect of volume ratios of ethanol on polyphenols recovery rate

圖5 洗脫曲線Fig.5 Elution curve of sesame leaf polyphenols on AB-8 macroporous resin

2.2.5 大孔樹脂純化前后芝麻葉多酚純度的測定 芝麻葉多酚粗提物、等強度洗脫物、梯度洗脫物中多酚含量的測定結果見表3。從表3看出，等強度洗脫中，50%、70%、95%（v/v）乙醇洗脫物中多酚含量接近，高于30%（v/v）乙醇洗脫物中多酚含量；但是在梯度洗脫中，芝麻葉多酚純度可由原來的16.88%±3.22%提高到45.71%±5.34%（p＜0.01）。在梯度洗脫中，30%、50%（v/v）乙醇洗脫物分別標記為SPP1、SPP2。結果顯示AB-8大孔樹脂對芝麻葉多酚初步純化的效果良好。

表3 芝麻葉多酚粗提物及純化部位中多酚純度Table 3 The contents of polyphenols in raw polyphenols and purified polyphenols from sesame leaf

2.3 芝麻葉多酚對牛血清白蛋白非酶糖基化的影響

2.3.1 牛血清白蛋白（BSA）非酶糖基化進程的熒光光譜 BSA經過非酶糖化反應最后形成的AGEs顯棕色，具有高度熒光性和交聯(lián)性。BSA非酶糖基化進程的熒光光譜見圖6。

圖6 牛血清白蛋白（BSA）非酶糖基化進程的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectrums of BSA non-enzyme glycation products at reaction proceeding

從圖6可知，非酶糖基化反應6h時的熒光光譜中峰位置在420nm。隨著反應的進行，到12～24h時，光譜圖在420～445nm范圍內呈現(xiàn)平臺樣；反應進行到30～42h時，光譜圖的峰位置長移到440nm。光譜形狀的改變是由熒光分子內部結構的改變引起的，而熒光強度的變化（峰值高低）則是由熒光物質含量的高低決定的。非酶條件下，牛血清白蛋白在高濃度葡萄糖環(huán)境中逐漸糖化生成了糖化蛋白即AGEs，同時，隨著牛血清白蛋白糖基化反應的進行，AGEs的濃度逐漸增加。

2.3.2 芝麻葉多酚對體外AGEs生成的抑制作用 芝麻葉多酚對體外AGEs生成的影響見圖7。

圖7 芝麻葉多酚對體外AGEs生成的影響Fig.7 Inhibitions of sesame leaf polyphenols and AG on the formation of AGEs in vitro

圖7 顯示，與陽性對照AG相比，芝麻葉多酚粗提物、SPP1、SPP2對AGEs生成均有明顯的抑制效應，劑量增加，抑制效率增加，其抑制能力由強到弱的順序為：SPP1≈多酚粗提物＞SPP2＞氨基胍。

3 結論

3.1 考察了五種不同大孔樹脂對多酚粗提物的靜態(tài)吸附及解吸效果，優(yōu)選出純化效果最好的AB-8大孔吸附樹脂，得到的最佳條件為：進樣量12.0mL，原料液濃度3.5mg·mL-1，進樣液pH5.0。采用3BV的50%（v/v）乙醇溶液洗脫，所得多酚純度可從16.88%提高到33.84%；若采用3BV的30%、50%（v/v）乙醇溶液進行梯度洗脫，純化產物分別命名為SPP1和SPP2，其多酚純度可分別達到28.43%和45.71%。

3.2 芝麻葉多酚粗提物、SPP1、SPP2對AGEs的生成具有明顯的抑制作用，抑制作用與其濃度之間存在劑量-效應關系，抑制效果均優(yōu)于陽性對照品氨基胍。因此，芝麻葉多酚能延緩蛋白質非酶糖基化進程因而具有潛在的預防或治療糖尿病的作用。對芝麻葉的深度開發(fā)利用能極大地提高這一農副產品的附加值，既符合食品研究發(fā)展方向，又與綠色經濟模式相一致。

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Purification and non-enzymatic glycation inhibitory activities of polyphenols from sesame leaf

LIU Jiang-hui1，LIU Jin-dun2，LIU Li-e3，YUAN Jun1
（1.School of Life Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.School of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.School of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Five kinds of macroporous adsorbent resins including D101，AB-8，NKA-9，S-8，ADS-5 and AB-8 resin were selected as a suitable material for the purification of sesame leaf polyphenols by static research，respectively.One factor-at-a-time method was used to determine the optimal operating conditions for purification of the polyphenols from sesame leaf.Then，the protein glycation inhibitory activity of polyphenols aqueous from sesame leaf was evaluated in vitro using the model system of bovine serum albumin and glucose.The results indicated that AB-8 macroporous resin has better adsorption and desorption ability to purify the raw polyphenols.The optimum conditions were as follows：sample solution 12.0mL，raw polyphenols concentration 3.5mg/mL，pH5.0.If the gradient elution was applied using 30%and 50%（v/v）ethanol for 3BV，purification products were named SPP1 and SPP2，the polyphenol contents were 28.43%（SPP1）and 45.71%（SPP2），respectively，while in crude samples the yield was 16.88%.As to advanced glycation end products（AGEs）formation inhibition activities，the raw polyphenol，SPP1 and SPP2 showed strong inhibitory effect on the development of non-enzymatic glycation reaction，much stronger than that of the positive control（Aminoguanidine），which suggests potential anti-diabetic properties.

sesame leaf；polyphenols；purification；advanced glycation end products

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.016

2013－09－10

劉江輝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：天然產物生物活性研究。

河南省教育廳科技攻關項目（13A330682）；福建農林大學青年教師科研基金重點項目：（ky0140040）。