周夢(mèng)嬌，萬春鵬，陳金?。ń鬓r(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

桂枝提取物抑菌活性研究

周夢(mèng)嬌，萬春鵬，陳金印*
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

以柑橘青、綠霉菌及獼猴桃灰霉菌等17種植物病原菌為指示菌，分別采用杯碟法、菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)桂枝提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明桂枝提取物具有較廣泛的抑菌譜，對(duì)這17種供試病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中對(duì)柑橘青、綠霉的抑菌圈大小分別為（32.67±0.23）mm和（30.50±0.17）mm，最小抑菌濃度（MIC）分別為3.125mg/mL和6.25mg/mL，最小殺菌濃度（MFC）分別為6.25mg/mL和12.5mg/mL，而在其他15種植物病原菌中，桂枝提取物對(duì)車前草穗枯菌的活性最強(qiáng)，半抑制濃度（EC50）為0.4386mg/mL，對(duì)其他病原菌的EC50為1～22mg/mL。

桂枝，植物病原菌，抑菌活性

植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)和采后貯藏最主要的瓶頸之一，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，每年因植物遭受病害造成的減產(chǎn)平均損失為總產(chǎn)量的10%～15%[1-2]。目前植物病害防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，但其殘留量大，對(duì)人和環(huán)境都有很大的危害，且使用的持續(xù)性及普遍性導(dǎo)致很多植物病原菌產(chǎn)生抗藥性[2]，隨著人類“回歸自然”的呼聲越來越高，國(guó)際社會(huì)把目光轉(zhuǎn)向了高效、低成本、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗性的天然植物提取物，如艾蒿、連翹、丁香、苦參等植物提取物因其具有較強(qiáng)的抗氧化性及抑菌效果，被廣泛應(yīng)用于食品防腐劑、抗氧化劑、果蔬貯藏保鮮劑、生物農(nóng)藥等方向[3]。我國(guó)中草藥資源豐富，大部分中草藥在中藥領(lǐng)域具有廣泛研究應(yīng)用，但只有少部分于植物病害防治方面得到了探究，因而亟需擴(kuò)大中草藥提取物及植物病原菌的篩選范圍。

桂枝（Ramulus cinnamomi）是樟科（Cinnamonum）常綠喬木植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl.）的干燥嫩枝，主要分布在廣西、廣東、云南、福建和海南等地，其性味辛、甘、溫，有發(fā)汗解肌、溫經(jīng)通脈之功效，中醫(yī)多用于治療風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛和關(guān)節(jié)痹痛等癥[4]，是一種運(yùn)用極其普遍的中藥，具有較好的抑菌[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7]和抗過敏[8]等藥理作用。目前對(duì)桂枝的研究多局限于醫(yī)藥方面，而將其運(yùn)用于植物病害防治方面未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究桂枝提取物對(duì)17種常見植物病原菌的抑菌活性，為充分開發(fā)利用桂枝資源及植物病害田間防治實(shí)驗(yàn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

的測(cè)定 二倍稀釋法稀釋桂枝提取液，并制得提取液終濃度為0.195～100mg/mL含藥培養(yǎng)基，平板涂布法將供試菌液均勻涂于培養(yǎng)基上，設(shè)置空白對(duì)照組（培養(yǎng)基不接種菌）、菌液對(duì)照組（培養(yǎng)基接種菌），將其置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，以無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的含藥濃度為其MIC，將無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)7d后觀察，以無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的含藥濃度為其MFC[11]，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2.4 桂枝提取物對(duì)其他15種植物病原菌抑菌活性的室內(nèi)毒力測(cè)定 參考方法[12]，無菌條件下，將不同體積的桂枝提取液加入到融化的PDA中，制成終濃度分別為25、5、1、0.2mg/mL的含藥培養(yǎng)基，以純PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，用直徑6mm打孔器打取活化好的各供試菌菌落的邊緣菌塊，分別將其轉(zhuǎn)接到各不同濃度的含藥PDA培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)3次，并將其置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后記錄各菌落生長(zhǎng)情況，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率：抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桂枝提取物對(duì)柑橘青、綠霉菌的抑制活性

由表1可知，桂枝提取物對(duì)柑橘青、綠霉菌的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的抑制作用，對(duì)柑橘青、綠霉菌的抑菌圈大?。?2.67±0.23）mm、（30.50±0.17）mm，此外，桂枝提取物在較低濃度對(duì)供試菌即表現(xiàn)出較好的抑制作用，對(duì)柑橘青、綠霉菌的MIC分別為3.125mg/mL和6.25mg/mL，MFC分別為6.25mg/mL和12.5mg/mL，因而柑橘青霉菌對(duì)桂枝提取物敏感性較優(yōu)于綠霉菌。

2.2 桂枝提取物對(duì)其他15種植物病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

表1 桂枝提取物對(duì)柑橘青、綠霉菌的抑制效果Table 1 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi extracts on P.italicum and P.digtium

以桂枝提取液的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，平均抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，用DPS軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得桂枝提取液對(duì)15種供試植物病原菌的毒力回歸方程，相關(guān)系數(shù)，EC50及其置信區(qū)間如表2所示。由表2可知，桂枝提取液對(duì)15種供試菌均有一定的抑菌活性，EC50能有效反映殺菌劑對(duì)病原菌抑制活性大小，EC50數(shù)值越小，說明殺菌劑對(duì)病原菌抑制活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中桂枝提取液對(duì)15種供試菌EC50值由小到大依次為：車前草穗枯病菌，獼猴挑擬莖點(diǎn)霉菌、玉黍蜀赤霉菌、棗擬莖點(diǎn)霉菌、水稻紋枯菌、西瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、茄褐紋菌、柑橘酸腐菌、萵苣菌核核盤菌、柑橘炭疽菌、獼猴桃灰霉菌、葡萄座腔菌、柑橘黑

1.1 材料與儀器

桂枝（Ramulus cinnamomi） 2013年3月5日購于江西省樟樹市華豐藥業(yè)公司；95%乙醇 分析純；PDA培養(yǎng)基 自制；柑橘青霉菌（Penicillium italicum）、柑橘綠霉菌（Penicillium digitatum）、柑橘炭疽菌（Colletotrichum glecosporioides）、柑 橘 酸 腐 菌（Geotrichum candidum）、柑橘黑斑菌（Phoma citricarpa）、獼猴桃灰霉菌（Botrytis cinerea）、獼猴桃擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis asparagi）、棗擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis mauritiana）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）、萵苣菌核核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄褐紋菌（Phomopsis vexans）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、芝麻鐮孢莖枯菌（Fusarium oxysporum）、水稻紋枯菌（Rhizoctonia solani）、玉黍蜀赤霉（Gibberella zeae）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）和車前草穗枯菌（Diaporthe angelicae） 均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司；KQ-500B超聲波清洗機(jī) 昆山超聲儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；LX-300冷卻水循環(huán)機(jī) 北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司；HS-1300U超凈工作臺(tái) 蘇靜集團(tuán)蘇州安泰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桂枝提取物的制備 參考課題組前期提取方法[9]，將桂枝于60℃真空干燥箱烘干后粉碎，過40目篩，取篩下粉末用95%乙醇溶劑超聲波輔助浸提2h，提取液減壓濃縮后離心，乙醇定容得到1g藥材/mL桂枝提取液。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定

1.2.2.1 菌種活化及菌懸液的配制 無菌條件下，將柑橘青、綠霉菌接種到斜面PDA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化一周，用無菌水將其分別洗入三角瓶中，過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使各菌液孢子濃度均為108cfu/mL。其余15種病原菌用直徑6mm打孔器打取各供試菌菌落的邊緣菌塊，并轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化一周，備用。

1.2.2.2 桂枝提取物對(duì)柑橘青、綠霉菌抑菌活性的測(cè)定 無菌條件下，吸取1mL供試菌液于99mL融化的PDA培養(yǎng)基中，使菌液終濃度為106cfu/mL[10]，搖勻后倒平板，采用杯碟法[9]，對(duì)桂枝提取物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，重復(fù)3次，將各平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2.3 桂枝提取物對(duì)柑橘青、綠霉菌的MIC和MFC斑菌和芝麻鐮孢莖枯菌。桂枝提取液對(duì)車前草穗枯病菌的抑菌效果最好，EC50為0.4386mg/mL，其毒力回歸方程為y=6.5999+4.0511x，斜率較大為4.0511，說明該病原菌對(duì)桂枝提取液較敏感。對(duì)獼猴挑擬莖點(diǎn)霉菌、玉黍蜀赤霉菌等12種供試菌的抑制效果次之，EC50分別在1～10mg/mL之間，對(duì)柑橘黑斑菌及芝麻鐮孢莖枯菌的抑制效果最差，EC50分別為13.9462mg/mL及21.1945mg/mL。

表2 桂枝提取液對(duì)15種植物病原菌的抑菌效果Table 2 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi against 15 phytopathogens

3 結(jié)論

桂枝對(duì)柑橘青、綠霉菌、獼猴桃灰霉菌等17種常見植物病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，因而桂枝提取物中含有抑制多種植物病原菌生長(zhǎng)的活性成分，有較為廣泛的抑菌譜，為充分開發(fā)利用桂枝這一植物資源，需進(jìn)一步完善其抑菌活性物質(zhì)提取、分離、純化方法，并進(jìn)行安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)，再結(jié)合構(gòu)效關(guān)系、化學(xué)仿生合成以滿足產(chǎn)業(yè)化需求。

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Study on antifungal activity of Ramulus cinnamomi

ZHOU Meng-jiao，WAN Chun-peng，CHEN Jin-yin*
（Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Non-destructive Testing of Fruits&Vegetables，College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Seventeen kinds of phytopathogens such as Penicillium italicum，Penicillium digitatum and Botrytis cinerea were used as indicators to explore the antifungal activities of Ramulus cinnamomi by cylind-plate and mycelial growth rates methods，respectively.The results showed that Ramulus cinnamomi had a broader spectrum antifungal activity against the 17 sorts of tested phytopathogens，the inhibition zones against P.italicum and P.digitatum were（32.67±0.23）mm and（30.50±0.17）mm，respectively.While the minimum inhibitory concentrations（MIC）gainst P.italicum and P.digitatum were 3.125mg/mL and 6.25mg/mL，respectively，and the minimum fungicidal（MFC）concentrations were 6.25mg/mL and 12.5mg/mL，respectively.Meanwhile，the toxicity of indoor test of Ramulus cinnamomi against the other 15 phytopathogens showed that Ramulus cinnamomi extracts had the best antifungal activity on Diaporthe angelicae with the EC50value of 0.4386mg/mL. The antifungal activities against other tested pathogens with EC50values ranged from 1 to 22mg/mL.

Ramulus cinnamomi；phytopathogens；antifungal activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0096-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.011

2013－09－16 *通訊聯(lián)系人

周夢(mèng)嬌（1990-），女，碩士研究生，研究方向：柑橘采后貯藏技術(shù)。

“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B03-2）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160343）；江西省教育廳科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（111）；江西省“贛博英才555工程（2012）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2011GB2C500017）；江西省博士后科研擇優(yōu)資助項(xiàng)目（2013KY31）；留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目（人社廳函[2013]277號(hào)）；中國(guó)博士后科學(xué)基金第54批面上項(xiàng)目（2013M541870）。