陸 嵐，丁 明，劉 青，潘麗峰

腹瀉是影響全世界最廣泛人群的一種疾病，病毒已被認(rèn)為是最重要的一類腹瀉病原［1］。引起腹瀉的病毒主要有諾如病毒(norovirus，NV)、輪狀病毒(rotavirus，RV)、扎如病毒(sapovirus，SPV)，星狀病毒(astrovirus，ASTV)和腸道腺病毒(enteric adenovirus，EADV)等。上海市浦東新區(qū)某學(xué)校于2013年11月發(fā)生1起急性胃腸炎疫情，病例主要臨床表現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉等，為了確定病原，以實(shí)時(shí)熒光定量方法(real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)對(duì)上述病毒進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)該起聚集性事件的病原?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 采集對(duì)象

首日采集腹瀉病例的肛拭標(biāo)本12例，環(huán)節(jié)樣品15例，繼續(xù)采集環(huán)節(jié)標(biāo)本及病例、生活老師、工作人員的肛拭標(biāo)本共計(jì)387例。具體的采集日期及數(shù)量見表1。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 QIAxtractor全自動(dòng)核酸抽提儀(德國(guó)QIAGEN公司)、OPTICON2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)、7500fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

表1樣本的采集情況(例)

1.2.2 主要試劑 檢測(cè)試劑均采用商品化核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒，其中，諾如病毒、腸道腺病毒試劑盒購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，輪狀病毒、星狀病毒和扎如病毒試劑盒購(gòu)自上海之江生物科技有限公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便標(biāo)本處理 將肛拭子插入含0.5 ml生理鹽水的Eppendorf管中，混勻，4 000 r/min離心2 min，r=6.0 cm，取上清用QIAxtractor全自動(dòng)核酸抽提儀提取核酸，得到總核酸體積為60 μl，備用。

1.3.2 RQ-PCR 檢測(cè)根據(jù)商品化的輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒、扎如病毒和腸道腺病毒實(shí)時(shí)熒光試劑盒說明書，將提取好的核酸樣本在OPTICON2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、7500fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以及7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR反應(yīng)。試劑配制及熒光PCR反應(yīng)條件參見試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 首日檢測(cè)結(jié)果

12例肛拭樣本中，有2份標(biāo)本檢出諾如病毒，輪狀病毒、扎如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒均為陰性。檢出率為16.67%。因此初步判斷本事件是由諾如病毒感染引起的。

2.2 后續(xù)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)后續(xù)采集樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，只有諾如病毒檢出，未檢出其他與腹瀉相關(guān)的病毒。后續(xù)的腹瀉患者、生活老師以及工作人員肛拭標(biāo)本的檢測(cè)情況見表2。

3 討論

諾如病毒感染是引起人類腹瀉的主要病因之一。感染對(duì)象為成人和較大年齡兒童，全年均有發(fā)生［2］。本次疫情發(fā)病者均為兒童和成年人，主要癥狀為惡心伴嘔吐，腹脹、腹瀉、腹痛。病程一般持續(xù)2～3 d，病情較輕。符合諾如病毒感染的一般臨床表現(xiàn)［3］。諾如病毒主要通過糞-口途徑感染，常見傳播途徑為諾如病毒污染的食品、水、生活接觸等。本次疫情筆者對(duì)樣品進(jìn)行多種病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果證明為諾如病毒感染。臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征均符合諾如病毒感染的特征。

諾如病毒潛伏期一般為24～48 h，實(shí)驗(yàn)室在本次聚集性事件中由2012年11月22日至2012年12月6日采集的標(biāo)本中持續(xù)檢出部分標(biāo)本諾如病毒核酸陽性，推測(cè)有繼代病例發(fā)生。諾如病毒對(duì)各種理化因子有較強(qiáng)的抵抗力，pH 2.7環(huán)境中暴露3 h，或者4℃、20%乙醚處理18 h，或者60℃孵育30 min，仍具有感染性［4］;并且能夠耐受普通飲用水中3.75×10-6～6.25×10-6的氯濃度(游離氯0.5×10-6～1.0×10-6)［5］。消毒、滅菌基本原則:重復(fù)使用的器具和物品，使用后應(yīng)首先清潔，再進(jìn)行消毒滅菌［6］。且食堂工作人員未對(duì)抹布進(jìn)行清洗直接浸入消毒液，因此食堂采用的消毒方法不能夠清除諾如病毒。在首次環(huán)境樣品檢測(cè)過程中，筆者忽略了該環(huán)節(jié)，主觀認(rèn)為經(jīng)過消毒液浸泡的抹布即時(shí)表面看來不干凈，但是細(xì)菌病毒應(yīng)該清除干凈。沒有進(jìn)行抹布的檢測(cè)，結(jié)果未找到傳染源，致使疫情不能在短期內(nèi)控制。

由于諾如病毒感染具有起病急、傳播快的特征，一旦出現(xiàn)疫情，應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。在確保樣品采集質(zhì)量及運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)符合規(guī)范要求的前提下，實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time PCR，RQ-PCR)方法進(jìn)行檢測(cè)，能夠快速、敏感的檢測(cè)出病源。

表2 腹瀉患者、生活老師及工作人員肛拭樣本檢測(cè)結(jié)果

［1］張海龍，李苑，張克春，等.2010年廣東省深圳市病毒性腹瀉監(jiān)測(cè)結(jié)果分析［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2012，27(1):4-7.

［2］金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)［M］.北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，2001:565-578.

［3］謝華萍，李巧艷，康燕，等.廣州市一起諾如病毒急性胃腸炎暴發(fā)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2010，26(8):669-671.

［4］胡必杰，倪曉平，覃金愛.醫(yī)院環(huán)境物體表面清潔與消毒最佳實(shí)踐［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2012:110-111.

［5］易彬樘，李東力.諾瓦克病毒流行病學(xué)研究概況與防治對(duì)策［J］.沈陽部隊(duì)醫(yī)藥，2007，20(5):344-347.

［6］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.WS/T367-2012醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范［S］.北京:中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2012.

(本文編輯:林永麗)