李科華，王慶敏，劉秋紅，戴圣龍，時(shí)粉周，姚永杰

生物的生理機(jī)能、生化代謝、行為表現(xiàn)等常以24 h為周期發(fā)生規(guī)律性變動(dòng)，這種變動(dòng)的節(jié)律稱(chēng)為近日節(jié)律。睡眠與覺(jué)醒、饑餓與口渴、血壓、心臟收縮次數(shù)、體溫、激素水平、免疫系統(tǒng)的功能等都隨著白天和黑夜的交替而發(fā)生著變化，呈現(xiàn)出固有的近日節(jié)律現(xiàn)象［1］，而這一現(xiàn)象依賴(lài)于位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleaus，SCN)的中樞振蕩器(central oscillators)和位于其他組織的外周振蕩器(peripheral oscillators)共同維持［2］。這些節(jié)律振蕩器的分子基礎(chǔ)是相關(guān)節(jié)律基因的表達(dá)，因此，正確理解生物體各種近日節(jié)律的特點(diǎn)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是要明確其節(jié)律基因的晝夜表達(dá)特點(diǎn)。

機(jī)體的免疫組分及免疫功能存在明顯的近日節(jié)律。外周血中的白細(xì)胞在維持機(jī)體免疫功能、抵抗微生物感染過(guò)程中起著重要的作用。筆者先前的研究表明［3］，小鼠外周血白細(xì)胞存在明顯的近日節(jié)律性，但其近日節(jié)律性是如何被基因調(diào)控的，目前尚不太清楚，本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定12L/12D光制條件下，白細(xì)胞中主要節(jié)律基因cry2，per2，timeless，rev-erb的晝夜表達(dá)特點(diǎn)。本研究不僅將為深入理解免疫系統(tǒng)功能的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，也將為深入理解特殊崗位人員(如航天員、長(zhǎng)航艦員及跨時(shí)區(qū)飛行的飛行員及乘員、護(hù)士等)由于工作崗位的需要導(dǎo)致的免疫功能近日節(jié)律紊亂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57/BL6小鼠48只，體質(zhì)量16～20 g，4～6周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

焦碳酸二乙酯(DEPC)、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒均購(gòu)自Takara公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自BD公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)動(dòng)物模型的建立:采用完全隨機(jī)分組方法將48只小鼠分為6組，分別對(duì)應(yīng)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組8只。將其置于穩(wěn)定的人工照明環(huán)境中喂養(yǎng)，室溫(20±2)℃，光照強(qiáng)度為250～300 Lx。光暗循環(huán)周期為12 L(光照條件)/12 D(黑暗條件)，其中光照時(shí)間為8:00-20:00，黑暗時(shí)間為20:00-8:00，小鼠自由攝食、飲水。光照4周后，6組小鼠分別在9:00、13:00、17:00、21:00、1:00、5:00 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用毛細(xì)玻璃管經(jīng)框后靜脈取血;黑暗期操作時(shí)紅光強(qiáng)度為10～15 Lx。

(2)節(jié)律基因引物設(shè)計(jì):引物的設(shè)計(jì)采用生物信息學(xué)軟件在線(xiàn)輔助完成。引物合成由上海生工生物有限公司完成。利用18s作為內(nèi)參，對(duì)各節(jié)律基因的豐度進(jìn)行校正。各基因引物分別如下:

cry2:forward primer 5'-TCG GCT CAA CAT TGA ACG AA-3'，reverse primer 5'-GGG CCA CTG GAT AGT GCT CT-3';

per2:forward primer 5'-GGC TTC ACC ATG CCT GTT GT-3'，reverse primer 5'-GGA GTT ATT TCG GAG GCA AGT GT-3';

rev-erb alpha:forward primer 5'-CGT TCG CAT CAA TCG CAA CC-3'，reverse primer 5'-GAT GTG GAG TAG GTG AGGTC-3';

timeless:forward primer 5'-CGA CGA AGA GGA AGA TGA TGAGG-3'，reverse primer 5'-TCC AAC TCA CAT CGG TCA AAC A-3';

18s:forward primer 5'-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3'，reverse primer 5'-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3';

(3)總RNA提取:外周血經(jīng)Na2EDTA抗凝處理(1∶1)后，再破紅處理;隨后按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA抽提。提取的RNA用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)260 nm和280 nm下測(cè)定光密度值(optical density，OD)，并計(jì)算OD260/OD280的比值。比值大于1.7的樣品，用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

(4)反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR:每個(gè)樣品取500 ng樣品RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)實(shí)驗(yàn)歩驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃5 s。所得 cDNA分別利用特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，利用18 s對(duì)各時(shí)鐘基因的豐度進(jìn)行校正。實(shí)時(shí)定量PCR試劑為T(mén)akara SYBR Premix-ExTaqⅡ(DRR820A)。采用儀器為Corvett RotorGene 60000。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中將第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)9:00的值作為1，其他各點(diǎn)均為相對(duì)于9:00時(shí)的值，計(jì)算2-Δct值。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間差異采用Student's t檢驗(yàn)比較。用Matlab分析軟件獲取節(jié)律相關(guān)參數(shù)，并經(jīng)振幅F檢驗(yàn)確定是否存在近日節(jié)律性。用于擬合的方程為:F(t)=M+Acos(ωt+φ)，其中，M為中值，即漲落變化的中線(xiàn)，A為節(jié)律震蕩的振幅，ω為上下波動(dòng)的幅度，φ為峰值相位，t是振蕩達(dá)到峰值的時(shí)刻。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cry2基因mRNA的晝夜表達(dá)特點(diǎn)

從圖1可以看出，24 h內(nèi)，外周血白細(xì)胞基因cry2 mRNA呈現(xiàn)明顯的近日節(jié)律性振蕩變化。峰值和谷值的 mRNA水平分別為2.196±0.193和0.509±0.037，峰值為谷值的4.3倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線(xiàn)為y=0.865 6+0.687 8×cos(15°/h×t+180°)，M=0.865 6，A=-0.687 8，峰值相位時(shí)間約為12:00。

圖1 LD光制條件下cry2基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達(dá)

2.2 per2基因mRNA的晝夜表達(dá)特點(diǎn)

從圖2可以看出，per2 mRNA晝夜水平變化很大，呈明顯的近日節(jié)律性。per2峰值和谷值的mRNA水平分別為4.000±0.381和0.321±0.027，峰值為谷值的12.5倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線(xiàn)為 y=2.042+0.206 4×cos(15°/h×t-67.04°)，M=2.042，A=0.206 4。峰值相位時(shí)間約為4∶28。

圖2 LD光制下per2基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達(dá)

2.3 timeless基因mRNA的晝夜表達(dá)特點(diǎn)

如圖3所示，timeless mRNA呈明顯的近日節(jié)律性。timeless峰值和谷值的mRNA水平分別為3.074±0.221和0.449±0.021，峰值為谷值6.8倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。timeless基因不同晝夜時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相對(duì)值，經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線(xiàn)為 y=1.24+0.807 6×cos(15°/h×t-172.74°)，M=1.24，A=0.807 6。峰值相位時(shí)間約為11∶30。

圖3 LD光制下timeless基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達(dá)

2.4 rev-erb基因mRNA的晝夜表達(dá)特點(diǎn)

如圖4所示，rev-erb基因mRNA呈明顯的近日節(jié)律性。rev-erb基因的mRNA峰值和谷值分別為3.605±0.212和0.761±0.080，峰值為谷值4.7倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。rev-erb基因不同晝夜時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相對(duì)值，經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線(xiàn)為y=1.603+0.542 6×cos(15°/h×t-166.88°)，M=1.603，A=0.542 6。峰值相位時(shí)間約為11∶07。

圖4 LD光制下rev-erb基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達(dá)

3 討論

相關(guān)研究表明，哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)(包括細(xì)胞免疫和體液免疫)在24 h內(nèi)數(shù)量和功能均存在近日節(jié)律性［4］。免疫功能近日節(jié)律的紊亂也會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［5］。研究表明，長(zhǎng)期夜班的女性患乳腺癌的機(jī)率明顯高于正常上班人群，而夜班的男性人群易患前列腺癌［6］。早期的研究顯示，體溫波動(dòng)規(guī)律的癌癥患者其預(yù)后明顯好于體溫不規(guī)律的患者。臨床研究顯示，休息活動(dòng)時(shí)間錯(cuò)亂的轉(zhuǎn)移癌患者其生存時(shí)間明顯縮短［7］。目前免疫系統(tǒng)近日節(jié)律失調(diào)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)已經(jīng)得到證實(shí)。在肝癌大鼠中發(fā)現(xiàn)，不但其免疫系統(tǒng)在構(gòu)成上發(fā)生變化，其原有的近日節(jié)律也遭到破壞。在HIV感染的患者中，T、B淋巴細(xì)胞的近日節(jié)律性逐漸喪失。導(dǎo)致免疫功能近日節(jié)律紊亂的根源可能在于相關(guān)近日節(jié)律基因的表達(dá)異常。正確理解免疫功能近日節(jié)律的前提是要明晰正常狀態(tài)下免疫組織、器官的節(jié)律調(diào)控基因的表達(dá)特點(diǎn)。相關(guān)研究表明，節(jié)律相關(guān)基因確實(shí)參與了哺乳動(dòng)物免疫功能的調(diào)控［8］。

哺乳動(dòng)物外周血中有大量的免疫細(xì)胞，在哺乳動(dòng)物免疫功能中起著重要的作用。筆者先前的研究表明，在小鼠循環(huán)血液中，白細(xì)胞總數(shù)及其分類(lèi)百分比在一晝夜時(shí)間里，存在明顯的近日節(jié)律。本研究中，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)外周血白細(xì)胞中的節(jié)律相關(guān)基因的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。由于節(jié)律基因的表達(dá)有周期性變化的特點(diǎn)，因此本研究中考慮了時(shí)間的因素，在一晝夜中每隔4 h檢測(cè)1次。

相關(guān)研究直接或間接證明，4種節(jié)律基因cry2、per2、timeless及rev-erb均在哺乳動(dòng)物近日節(jié)律反饋環(huán)中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子作用，但它們?cè)谕庵苎准?xì)胞中是否存在近日節(jié)律性目前尚未明確。小鼠cry基因分布在多個(gè)組織，mcry2基因在中樞和外周視網(wǎng)膜高度表達(dá)，該基因敲除后，可使節(jié)律周期延長(zhǎng)1 h，這說(shuō)明它在哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)中發(fā)揮光導(dǎo)作用。mper2參與哺乳動(dòng)物近日節(jié)律負(fù)反饋的調(diào)節(jié)。timeless在鼠SCN中高表達(dá)，但節(jié)律性很弱或無(wú)節(jié)律，而在視網(wǎng)膜高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tim蛋白可以抑制clock:bmɑl1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄［9］。rev-erb通過(guò)抑制正向調(diào)節(jié)因子bmɑl1的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，C57/BL6小鼠外周血白細(xì)胞中per2、cry2、timeless、rev-erb基因mRNA峰值與谷值差異明顯(P＜0.01)，存在著明顯的近日節(jié)律性。從峰值時(shí)間和震蕩幅度看，cry2、timeless、rev-erb峰值時(shí)間比per2超前，振幅也比per2高(P＜0.01)，因此cry2、timeless、rev-erb負(fù)反饋的作用強(qiáng)于per2，而cry2、timeless、rev-erb的峰值時(shí)間、振幅大小比較接近，所以3者在外周血白細(xì)胞近日節(jié)律調(diào)節(jié)中的負(fù)反饋?zhàn)饔帽容^相近。

目前，SCN中的近日節(jié)律的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)基本明確，即clock:bmɑl1在哺乳動(dòng)物中樞震蕩器中以異二聚體形式結(jié)合，充當(dāng)正向調(diào)節(jié)因子;而per和cry充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)因子。周?chē)M織的近日節(jié)律調(diào)控機(jī)制不盡相同。相關(guān)研究［10］表明，肝、腎及脾臟中的近日節(jié)律調(diào)控存在明顯差異，在腎和脾中，cry1和cry2在負(fù)反饋中占主要作用，而肝臟中per1在負(fù)反饋中占主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)的外周血白細(xì)胞近日節(jié)律的調(diào)控機(jī)制與肝、腎、脾的節(jié)律調(diào)控機(jī)制有所不同。

本研究結(jié)果明確了小鼠外周血白細(xì)胞中的4種主要節(jié)律基因cry2、per2、timeless、rev-erb存在明顯的近日節(jié)律性，這提示，它們可能參與了光誘導(dǎo)下外周血白細(xì)胞近日節(jié)律的調(diào)節(jié)。但它們?nèi)绾螀⑴c外周血相關(guān)免疫細(xì)胞的調(diào)控，及在各種免疫細(xì)胞中所起的作用尚需進(jìn)一步研究。本研究不但為深入認(rèn)識(shí)免疫功能近日節(jié)律紊亂相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程，而且為指導(dǎo)疾病的早期診斷提供了依據(jù)，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

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(本文編輯:彭潤(rùn)松)