李科華，王慶敏，劉秋紅，戴圣龍，時粉周，姚永杰

生物的生理機能、生化代謝、行為表現(xiàn)等常以24 h為周期發(fā)生規(guī)律性變動，這種變動的節(jié)律稱為近日節(jié)律。睡眠與覺醒、饑餓與口渴、血壓、心臟收縮次數(shù)、體溫、激素水平、免疫系統(tǒng)的功能等都隨著白天和黑夜的交替而發(fā)生著變化，呈現(xiàn)出固有的近日節(jié)律現(xiàn)象［1］，而這一現(xiàn)象依賴于位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleaus，SCN)的中樞振蕩器(central oscillators)和位于其他組織的外周振蕩器(peripheral oscillators)共同維持［2］。這些節(jié)律振蕩器的分子基礎是相關(guān)節(jié)律基因的表達，因此，正確理解生物體各種近日節(jié)律的特點，關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是要明確其節(jié)律基因的晝夜表達特點。

機體的免疫組分及免疫功能存在明顯的近日節(jié)律。外周血中的白細胞在維持機體免疫功能、抵抗微生物感染過程中起著重要的作用。筆者先前的研究表明［3］，小鼠外周血白細胞存在明顯的近日節(jié)律性，但其近日節(jié)律性是如何被基因調(diào)控的，目前尚不太清楚，本研究利用實時定量PCR技術(shù)測定12L/12D光制條件下，白細胞中主要節(jié)律基因cry2，per2，timeless，rev-erb的晝夜表達特點。本研究不僅將為深入理解免疫系統(tǒng)功能的調(diào)控機制提供依據(jù)，也將為深入理解特殊崗位人員(如航天員、長航艦員及跨時區(qū)飛行的飛行員及乘員、護士等)由于工作崗位的需要導致的免疫功能近日節(jié)律紊亂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57/BL6小鼠48只，體質(zhì)量16～20 g，4～6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 實驗試劑

焦碳酸二乙酯(DEPC)、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒均購自Takara公司，紅細胞裂解液購自BD公司，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自上海生工生物有限公司。

1.3 試驗方法

(1)動物模型的建立:采用完全隨機分組方法將48只小鼠分為6組，分別對應6個時間點，每組8只。將其置于穩(wěn)定的人工照明環(huán)境中喂養(yǎng)，室溫(20±2)℃，光照強度為250～300 Lx。光暗循環(huán)周期為12 L(光照條件)/12 D(黑暗條件)，其中光照時間為8:00-20:00，黑暗時間為20:00-8:00，小鼠自由攝食、飲水。光照4周后，6組小鼠分別在9:00、13:00、17:00、21:00、1:00、5:00 6個時間點，用毛細玻璃管經(jīng)框后靜脈取血;黑暗期操作時紅光強度為10～15 Lx。

(2)節(jié)律基因引物設計:引物的設計采用生物信息學軟件在線輔助完成。引物合成由上海生工生物有限公司完成。利用18s作為內(nèi)參，對各節(jié)律基因的豐度進行校正。各基因引物分別如下:

cry2:forward primer 5'-TCG GCT CAA CAT TGA ACG AA-3'，reverse primer 5'-GGG CCA CTG GAT AGT GCT CT-3';

per2:forward primer 5'-GGC TTC ACC ATG CCT GTT GT-3'，reverse primer 5'-GGA GTT ATT TCG GAG GCA AGT GT-3';

rev-erb alpha:forward primer 5'-CGT TCG CAT CAA TCG CAA CC-3'，reverse primer 5'-GAT GTG GAG TAG GTG AGGTC-3';

timeless:forward primer 5'-CGA CGA AGA GGA AGA TGA TGAGG-3'，reverse primer 5'-TCC AAC TCA CAT CGG TCA AAC A-3';

18s:forward primer 5'-TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3'，reverse primer 5'-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3';

(3)總RNA提取:外周血經(jīng)Na2EDTA抗凝處理(1∶1)后，再破紅處理;隨后按Trizol試劑說明書進行RNA抽提。提取的RNA用紫外分光光度計，在波長260 nm和280 nm下測定光密度值(optical density，OD)，并計算OD260/OD280的比值。比值大于1.7的樣品，用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實驗。

(4)反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR:每個樣品取500 ng樣品RNA，進行反轉(zhuǎn)錄。反應實驗歩驟嚴格按照試劑盒說明書進行。反應條件為37℃ 15 min，85℃5 s。所得 cDNA分別利用特異引物進行實時定量PCR擴增，反應條件參照試劑盒說明書進行，利用18 s對各時鐘基因的豐度進行校正。實時定量PCR試劑為Takara SYBR Premix-ExTaqⅡ(DRR820A)。采用儀器為Corvett RotorGene 60000。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗中將第一個時間點9:00的值作為1，其他各點均為相對于9:00時的值，計算2-Δct值。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差±s)表示，組間差異采用Student's t檢驗比較。用Matlab分析軟件獲取節(jié)律相關(guān)參數(shù)，并經(jīng)振幅F檢驗確定是否存在近日節(jié)律性。用于擬合的方程為:F(t)=M+Acos(ωt+φ)，其中，M為中值，即漲落變化的中線，A為節(jié)律震蕩的振幅，ω為上下波動的幅度，φ為峰值相位，t是振蕩達到峰值的時刻。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 cry2基因mRNA的晝夜表達特點

從圖1可以看出，24 h內(nèi)，外周血白細胞基因cry2 mRNA呈現(xiàn)明顯的近日節(jié)律性振蕩變化。峰值和谷值的 mRNA水平分別為2.196±0.193和0.509±0.037，峰值為谷值的4.3倍左右，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線為y=0.865 6+0.687 8×cos(15°/h×t+180°)，M=0.865 6，A=-0.687 8，峰值相位時間約為12:00。

圖1 LD光制條件下cry2基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達

2.2 per2基因mRNA的晝夜表達特點

從圖2可以看出，per2 mRNA晝夜水平變化很大，呈明顯的近日節(jié)律性。per2峰值和谷值的mRNA水平分別為4.000±0.381和0.321±0.027，峰值為谷值的12.5倍左右，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線為 y=2.042+0.206 4×cos(15°/h×t-67.04°)，M=2.042，A=0.206 4。峰值相位時間約為4∶28。

圖2 LD光制下per2基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達

2.3 timeless基因mRNA的晝夜表達特點

如圖3所示，timeless mRNA呈明顯的近日節(jié)律性。timeless峰值和谷值的mRNA水平分別為3.074±0.221和0.449±0.021，峰值為谷值6.8倍左右，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。timeless基因不同晝夜時間點的表達相對值，經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線為 y=1.24+0.807 6×cos(15°/h×t-172.74°)，M=1.24，A=0.807 6。峰值相位時間約為11∶30。

圖3 LD光制下timeless基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達

2.4 rev-erb基因mRNA的晝夜表達特點

如圖4所示，rev-erb基因mRNA呈明顯的近日節(jié)律性。rev-erb基因的mRNA峰值和谷值分別為3.605±0.212和0.761±0.080，峰值為谷值4.7倍左右，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。rev-erb基因不同晝夜時間點的表達相對值，經(jīng)余弦函數(shù)軟件分析，得到最佳的擬合余弦曲線為y=1.603+0.542 6×cos(15°/h×t-166.88°)，M=1.603，A=0.542 6。峰值相位時間約為11∶07。

圖4 LD光制下rev-erb基因mRNA水平晝夜節(jié)律性表達

3 討論

相關(guān)研究表明，哺乳動物的免疫系統(tǒng)(包括細胞免疫和體液免疫)在24 h內(nèi)數(shù)量和功能均存在近日節(jié)律性［4］。免疫功能近日節(jié)律的紊亂也會導致疾病的發(fā)生［5］。研究表明，長期夜班的女性患乳腺癌的機率明顯高于正常上班人群，而夜班的男性人群易患前列腺癌［6］。早期的研究顯示，體溫波動規(guī)律的癌癥患者其預后明顯好于體溫不規(guī)律的患者。臨床研究顯示，休息活動時間錯亂的轉(zhuǎn)移癌患者其生存時間明顯縮短［7］。目前免疫系統(tǒng)近日節(jié)律失調(diào)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)已經(jīng)得到證實。在肝癌大鼠中發(fā)現(xiàn)，不但其免疫系統(tǒng)在構(gòu)成上發(fā)生變化，其原有的近日節(jié)律也遭到破壞。在HIV感染的患者中，T、B淋巴細胞的近日節(jié)律性逐漸喪失。導致免疫功能近日節(jié)律紊亂的根源可能在于相關(guān)近日節(jié)律基因的表達異常。正確理解免疫功能近日節(jié)律的前提是要明晰正常狀態(tài)下免疫組織、器官的節(jié)律調(diào)控基因的表達特點。相關(guān)研究表明，節(jié)律相關(guān)基因確實參與了哺乳動物免疫功能的調(diào)控［8］。

哺乳動物外周血中有大量的免疫細胞，在哺乳動物免疫功能中起著重要的作用。筆者先前的研究表明，在小鼠循環(huán)血液中，白細胞總數(shù)及其分類百分比在一晝夜時間里，存在明顯的近日節(jié)律。本研究中，利用實時定量PCR技術(shù)對外周血白細胞中的節(jié)律相關(guān)基因的表達特性進行了研究。由于節(jié)律基因的表達有周期性變化的特點，因此本研究中考慮了時間的因素，在一晝夜中每隔4 h檢測1次。

相關(guān)研究直接或間接證明，4種節(jié)律基因cry2、per2、timeless及rev-erb均在哺乳動物近日節(jié)律反饋環(huán)中發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)因子作用，但它們在外周血白細胞中是否存在近日節(jié)律性目前尚未明確。小鼠cry基因分布在多個組織，mcry2基因在中樞和外周視網(wǎng)膜高度表達，該基因敲除后，可使節(jié)律周期延長1 h，這說明它在哺乳動物晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)中發(fā)揮光導作用。mper2參與哺乳動物近日節(jié)律負反饋的調(diào)節(jié)。timeless在鼠SCN中高表達，但節(jié)律性很弱或無節(jié)律，而在視網(wǎng)膜高表達。體外實驗證實，Tim蛋白可以抑制clock:bmɑl1介導的轉(zhuǎn)錄［9］。rev-erb通過抑制正向調(diào)節(jié)因子bmɑl1的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，C57/BL6小鼠外周血白細胞中per2、cry2、timeless、rev-erb基因mRNA峰值與谷值差異明顯(P＜0.01)，存在著明顯的近日節(jié)律性。從峰值時間和震蕩幅度看，cry2、timeless、rev-erb峰值時間比per2超前，振幅也比per2高(P＜0.01)，因此cry2、timeless、rev-erb負反饋的作用強于per2，而cry2、timeless、rev-erb的峰值時間、振幅大小比較接近，所以3者在外周血白細胞近日節(jié)律調(diào)節(jié)中的負反饋作用比較相近。

目前，SCN中的近日節(jié)律的調(diào)控機制已經(jīng)基本明確，即clock:bmɑl1在哺乳動物中樞震蕩器中以異二聚體形式結(jié)合，充當正向調(diào)節(jié)因子;而per和cry充當負調(diào)節(jié)因子。周圍組織的近日節(jié)律調(diào)控機制不盡相同。相關(guān)研究［10］表明，肝、腎及脾臟中的近日節(jié)律調(diào)控存在明顯差異，在腎和脾中，cry1和cry2在負反饋中占主要作用，而肝臟中per1在負反饋中占主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)的外周血白細胞近日節(jié)律的調(diào)控機制與肝、腎、脾的節(jié)律調(diào)控機制有所不同。

本研究結(jié)果明確了小鼠外周血白細胞中的4種主要節(jié)律基因cry2、per2、timeless、rev-erb存在明顯的近日節(jié)律性，這提示，它們可能參與了光誘導下外周血白細胞近日節(jié)律的調(diào)節(jié)。但它們?nèi)绾螀⑴c外周血相關(guān)免疫細胞的調(diào)控，及在各種免疫細胞中所起的作用尚需進一步研究。本研究不但為深入認識免疫功能近日節(jié)律紊亂相關(guān)疾病的發(fā)病機制、病理生理過程，而且為指導疾病的早期診斷提供了依據(jù)，具有重要的理論意義和應用價值。

［1］Frédéric G，Emi N，Steven A，et al.The mammalian circadian timing system:from gene expression to physiology［J］.Chromosoma，2004，113(3):103-112.

［2］杜玉珍，童建.生物鐘的基因調(diào)控［J］.生理科學進展，2002，33(4):343-345.

［3］王慶敏，時粉周，唐瑛，等.小鼠外周血免疫相關(guān)細胞的近日節(jié)律性研究［J］.海軍醫(yī)學雜志，2013，34(4):289-293.

［4］Litvinenko GI，Shurlygina AV，Verbitskaya LV，et al.Circadian dynamics of cell composition of the thymus and lymph nodes in mice normally，under conditions of permanent illumination，and after melatonin injection［J］.Bull Exp Biol Med，2005，140(2):213-216.

［5］Rafnsson V，Tulinius H，Jónasson JG，et al.Risk of breast cancer in female flight attendants:a population-based study(Iceland)［J］.Canc Caus Contr，2001，12(2):95-101.

［6］Mormont MC，Waterhouse J，Bleuzen P.Marked 24h rest/activity rhythms are associated with better quality of life，better response，and longer survival in patients with metastatic colorectal cancer and good performance status［J］.Cancer Res，2000，(6):3038-3045.

［7］Naidu KS，Morgan LW，Bailey MJ.Inflammation in the avian spleen:timing is everything［J］.BMC Mol Biol，2010，31(11):104-116.

［8］Dunlap JC.Molecular bases for circadian clock［J］.Cell，1999，96:271-290.

［9］Nicolas P，F(xiàn)rancesca D.The orphan nuclear receptor REV-ERBɑ controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian oscillator［J］.Cell，2002，110:251-260.

［10］劉姝，蔡彥寧，謝淑，等.C57小鼠肝、腎、脾、胸腺組織時鐘基因的表達特點［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2007，27(12):1305-1308.

(本文編輯:彭潤松)