楊曉婧，趙紅玲，高　楊，尹志峰，王良友

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德　067000)

技術(shù)方法

利用離子交換樹(shù)脂和超濾膜純化還原型谷胱甘肽的研究

楊曉婧，趙紅玲，高楊，尹志峰，王良友

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000)

離子交換樹(shù)脂;超濾膜;分離純化

谷胱甘肽(GSH)，即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的活性三肽，是細(xì)胞內(nèi)非蛋白硫氫基團(tuán)的主要組成部分，在活組織中具有護(hù)肝、解毒、清除自由基、抗氧化等重要的生理功能。臨床上，GSH主要用于治療肝臟疾病，也是治療眼科疾病的藥物，如早期老年性白內(nèi)障、角膜潰瘍、角膜炎等;同時(shí)，GSH也應(yīng)用在食品和保健品上。隨著對(duì)GSH研究的深入，在醫(yī)療、食品、保健等方便對(duì)GSH的需求量正在不斷增加[1-2]。

傳統(tǒng)分離純化GSH的方法大多采用銅鹽法、雙水相法和樹(shù)脂法，這些方法存在著污染嚴(yán)重、操作系統(tǒng)昂貴等不能量產(chǎn)的缺點(diǎn)[3]。由于GSH是兩性物質(zhì)且?guī)в幸欢ǖ碾姾?，而超濾膜的實(shí)驗(yàn)操作條件溫和，在pH 1-14時(shí)均穩(wěn)定，并能在90℃下正常工作，不易引起液體溫度、pH的變化，可以防止生物大分子的變性、失活和自溶[4]。因此，本研究先選用超濾膜除去抽提液中的大分子蛋白，再利用離子交換樹(shù)脂法分離GSH，選用001×7陽(yáng)離子樹(shù)脂分離純化GSH，該方法省時(shí)有效，收率高。

1 試劑與儀器

1.1原料含有GSH的酵母抽提液，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2主要試劑GSH標(biāo)準(zhǔn)品(上海哈靈生物科技有限公司);001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(上海水益樹(shù)脂有限公司);超濾膜，截留分子量為3000Da(杭州濾元膜科技有限公司);其余試劑均為分析純。

1.3主要儀器Alltechp4426高效液相色譜儀(美國(guó)奧泰科技公司);色譜柱:ODS C18(250×4.6mm);752可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);BT01-100恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司);Alphal-4LD冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1GSH抽提液的制備收集冷凍的菌泥加水混勻后，100℃處理10min，4000r/min離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)pH值為3。

2.2樹(shù)脂的預(yù)處理一定量樹(shù)脂→去離子水浸泡洗滌→1mol/L HCl浸泡(用量約為樹(shù)脂的2-3倍)→去離子水洗至流出液pH值為中性→1mol/L NaOH浸泡(用量約為樹(shù)脂的2-3倍)→1mol/L HCl浸泡(用量約為樹(shù)脂的4-5倍)→去離子水洗至流出液pH為中性以上備用(注意不要產(chǎn)生氣泡)。

2.3超濾膜的處理對(duì)超濾膜進(jìn)行了操作溫度和離心轉(zhuǎn)速的考察。

2.3.1操作溫度對(duì)超濾膜的影響:控制離心轉(zhuǎn)速為4000r/ min的條件下，探討不同溫度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)對(duì)膜截留量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1:膜截留量隨溫度的升高而升高，溫度升高有利于傳質(zhì)、膜截留量增大，但考慮到高溫易使蛋白質(zhì)變性失活，操作溫度宜選擇25℃。

圖1 操作溫度對(duì)超濾膜的影響

2.3.2離心轉(zhuǎn)速對(duì)超濾膜的影響:控制洗脫液溫度為25℃，探討不同離心轉(zhuǎn)速(2000r/min、3000r/min、4000r/ min)對(duì)膜截留量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2:膜截留量隨轉(zhuǎn)速的增加而升高，峰值出現(xiàn)在4000r/min，為最佳轉(zhuǎn)速。

圖2 離心轉(zhuǎn)速對(duì)超濾膜的影響

2.4靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)將2.2中處理過(guò)的樹(shù)脂放入錐形瓶中，分別調(diào)pH值為2、3、4、5、6后加入GSH抽提液，25℃下恒溫振蕩，每隔30min測(cè)定一次樹(shù)脂吸附量，直至吸附量基本不變。圖3為上樣30min、60min后測(cè)得樹(shù)脂吸附GSH的量，結(jié)果顯示:樹(shù)脂對(duì)GSH的吸附在pH=2時(shí)出現(xiàn)峰值，但吸附的雜質(zhì)較多，再結(jié)合GSH的性質(zhì)綜合考慮，因此應(yīng)采用pH=3。圖4顯示，樹(shù)脂在90min時(shí)吸附量基本達(dá)到飽和狀態(tài)，至反應(yīng)24h后吸附量仍然不變。通過(guò)四氧嘧啶法計(jì)算樹(shù)脂的吸附量為1.153mg GSH/g樹(shù)脂。

圖3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)pH值選擇結(jié)果

圖4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5洗脫流速的選擇取GSH抽提液，調(diào)節(jié)pH值為3，上樣，適量洗脫液洗脫，以確定合適的洗脫速度。結(jié)果見(jiàn)圖5:洗脫液吸光度值A(chǔ)最大效果最佳，即最佳流速為2ml/min。洗脫時(shí)，流速不僅影響GSH的洗脫效果，還會(huì)影響洗脫體積。洗脫太慢，洗脫液體積大，耗時(shí)長(zhǎng);洗脫快，GSH洗脫率低，損耗大。

圖5 不同流速對(duì)GSH洗脫的影響

2.6洗脫液的選擇分別選用0.1M冰醋酸、0.35M冰醋酸，0.1M NaOH、0.2M NaOH，0.3M醋 酸 鈉+0.1M NaOH作為洗脫劑，檢測(cè)洗脫液中GSH的含量，并計(jì)算GSH的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1:用冰醋酸洗脫時(shí)體積較大，凍干繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)。因此，選擇洗脫體積小且回收率高的0.2M NaOH洗脫，且GSH能集中洗脫下來(lái)，所含雜質(zhì)較少。

表1 不同試劑洗脫對(duì)GSH回收率的影響

2.7洗脫終點(diǎn)的判斷采用亞硝基鐵氰化鈉法檢測(cè)，取一滴洗脫液，滴入1.5%亞硝基鐵氰化鈉溶液(飽和硫酸銨溶液配制)，觀察顏色變化，如果顏色變?yōu)榧t色，表明還未洗脫完全，反之，則洗脫液中無(wú)GSH存在，停止洗脫。

2.8GSH的測(cè)定采用HPLC法測(cè)定GSH的純度，選用C18柱，流動(dòng)相:緩沖液A:0.1%TFA,H2O，緩沖液B:0.1%TFA，CH3CN，恒度洗脫，A:B=95:5(體積比);流速:0.8ml/min，測(cè)波長(zhǎng):214nm。結(jié)果顯示樣品出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品比較，時(shí)間基本一致，初步確定產(chǎn)品為GSH，所得產(chǎn)品的HPLC純度為37.55%。

2.9001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)GSH的分離純化重復(fù)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)結(jié)果在25℃、4000r/min的條件下利用超濾膜除去大分子蛋白，上柱最適宜pH=3，洗脫液為0.2M NaOH，洗脫流速為2.0ml/min，進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)。果見(jiàn)表2，GSH的平均回收率為73.94%。

表2　001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)GSH的分離純化重復(fù)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

采用001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和超濾膜結(jié)合的方法分離純化GSH，結(jié)果顯示此方法可行，可為GSH的進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定在25℃、4000r/min的條件下利用超濾膜除去大分子蛋白，上柱最適宜pH值為3洗脫液為0.2M NaOH，洗脫流速為2.0ml/min，產(chǎn)品GSH的純度為37.55%。

[1]王大慧,衛(wèi)功元.谷胱甘肽的應(yīng)用前景及生產(chǎn)研究現(xiàn)狀[J].化學(xué)與生物工程,2004,(3):10-12.

[2]周宇光,付國(guó)平,肖仔君.谷胱甘肽的生產(chǎn)和應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2003,(3):89-91.

[3]邱雁臨,胡靜,繆謹(jǐn)楓,等.利用大孔樹(shù)脂從啤酒廢酵母中分離谷胱甘肽[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(1):83-86.

[4]樊文玲,詹秀琴,林瑛.超濾膜分離地龍勻漿液中蛋白物質(zhì)的操作條件優(yōu)化研究[J].中成藥，2007，29(11):1598-1601.

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1004-6879(2014)03-0239-03

2013-10-16)