張 揚(yáng)，許 倩，陳 龍，李 欣

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,河北承德 067000)

膜聯(lián)蛋白A7在胃癌組織中的表達(dá)及意義

張 揚(yáng)，許 倩，陳 龍，李 欣△

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,河北承德 067000)

目的:探討膜聯(lián)蛋白A7在胃癌組織中的表達(dá)變化和意義。方法:分別采用SP免疫組織化學(xué)染色法和Western Blotting法檢測膜聯(lián)蛋白A7在55例胃癌組織和25例癌旁正常胃組織中的表達(dá)情況。結(jié)果:胃癌組織膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:膜聯(lián)蛋白A7高表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

膜聯(lián)蛋白A7;胃癌;腫瘤

2003-2007年中國胃癌發(fā)病與死亡情況分析報道指出，我國胃癌發(fā)病率為33.14/10萬，在新發(fā)生的各類癌癥中居第2位，胃癌死亡率為24.34/10萬，居癌癥死亡的第3位[1]。膜聯(lián)蛋白A7是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，屬于膜聯(lián)蛋白A家族的成員，具有參與細(xì)胞骨架活動、膜受體功能的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂信息以及促進(jìn)細(xì)胞分泌等重要功能[2]。研究顯示，前列腺癌、子宮頸鱗癌等多種腫瘤組織膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)異常[3-4]。本研究旨在觀察胃癌組織膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)的變化，初步探討膜聯(lián)蛋白A7與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2011年6月至2012年12月，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃癌手術(shù)切除標(biāo)本55例、癌旁正常胃組織(與癌組織距離＞5cm)25例，所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。55例胃癌患者，男31例、女24例;年齡28-85歲(中位年齡57歲)，＜60歲23例、＞60歲32例;病理組織學(xué)分型:管狀腺癌38例、粘液腺癌和印戒細(xì)胞癌17例;腫瘤分化程度:高、中分化20例，低分化35例;浸潤深度:腫瘤未侵及漿膜30例，突破漿膜和侵及鄰近結(jié)構(gòu)25例。所取組織一部分10%中性甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、5μm連續(xù)切片，一部分入液氮保存。

1.2 主要試劑 膜聯(lián)蛋白A7小鼠抗單克隆抗體，

Invitrogen公司;免疫組織化學(xué)試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司;β-actin小鼠抗單克隆抗體，Santa Cruz公司。

1.3 膜聯(lián)蛋白A7蛋白表達(dá)的檢測

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色:采用SP免疫組織化學(xué)染色法，一抗工作濃度1:150，以PBS替代一抗作為陰性對照。在顯微鏡(10×40倍)下觀察拍照，每張切片上隨機(jī)選5個視野，每個標(biāo)本計數(shù)3張切片，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)分析陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值，取平均值作為膜聯(lián)蛋白A7的相對表達(dá)水平。

1.3.2 Western Blotting法:取100mg左右液氮保存組織，放入勻漿器中，加1ml細(xì)胞裂解液冰上勻漿，收集勻漿懸液，4℃，12000r/min離心15min，取上清，BCA法測蛋白濃度，加5×loading Buffer，95℃變性10min，50μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3h，膜聯(lián)蛋白A7抗體(1:1000)4℃過夜，TBST洗膜3×10min/次，羊抗鼠二抗(1:3000)搖床上孵育1h，TBST洗膜3×5min/次，ECL發(fā)光，顯影。FUJI Mini-4000掃描Western Blotting圖像，應(yīng)用Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶光密度與β-actin條帶光密度的比值，作為膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)的相對水平。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá):免疫組化染色結(jié)果顯示，膜聯(lián)蛋白A7免疫陽性產(chǎn)物位于胃腺上皮細(xì)胞胞漿，呈淡黃色或棕黃色。定量分析結(jié)果顯示，胃癌組織膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見附表。

附表 不同胃組織膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)(±s)

附表 不同胃組織膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)(±s)

免疫組化染色 Western Blotting胃癌 0.183±0.025 1.483±0.258癌旁正常組織 0.072±0.033 0.623±0.326 P ＜0.05 ＜0.05

3 討論

膜聯(lián)蛋白A7是Creutz等[5]首次從牛腎上腺髓質(zhì)分離、純化的一種能聚集嗜鉻細(xì)胞顆粒的Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，包括兩個基本的功能結(jié)構(gòu)域:一個高度可變的氨基末端結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的核心結(jié)構(gòu)域。保守的核心結(jié)構(gòu)域有Ca2+和磷脂的結(jié)合位點(diǎn)，有利于依賴鈣離子促進(jìn)膜的融合;氨基末端結(jié)構(gòu)域則高度可變，與每一種膜聯(lián)蛋白各自的特性有關(guān)[6]。

近年來，膜聯(lián)蛋白A7與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究逐漸增多。Srivastava等[7]研究137例敲除膜聯(lián)蛋白A7基因的小鼠發(fā)現(xiàn)，23%的突變體小鼠發(fā)生自發(fā)性腫瘤，表明膜聯(lián)蛋白A7基因表達(dá)缺失參與了腫瘤的發(fā)展過程。此后，膜聯(lián)蛋白A7與腫瘤相關(guān)的類似研究成果相繼呈現(xiàn)。Srivastava等[3]發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)顯著降低;Hung等[8]發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)也顯著下調(diào)。但也有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果不同，Srivastava研究膜聯(lián)蛋白A7在乳腺癌中的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，乳腺癌膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)明顯上調(diào);陳雪等[4]關(guān)于宮頸鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，從蛋白水平和mRNA水平膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)都是升高的。李欣等[9]利用RNA干擾技術(shù)降低膜聯(lián)蛋白A7在宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞的增殖速度明顯減慢、凋亡增多，表明膜聯(lián)蛋白A7可能具有促進(jìn)Hela細(xì)胞增長的作用，提示膜聯(lián)蛋白A7基因可能是一個促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的基因。

本研究分別采用免疫組織化學(xué)染色法、Western Blotting法研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織膜聯(lián)蛋白A7的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃組織。結(jié)合其他學(xué)者的研究成果，推測膜聯(lián)蛋白A7在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有促進(jìn)作用，并提示膜聯(lián)蛋白A7可能是一個新的參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物，因此，本研究可為胃癌的臨床診斷提供一個新的參考指標(biāo)。但膜聯(lián)蛋白A7在胃癌發(fā)生過程中具體的作用機(jī)制如何，有待進(jìn)一步研究。

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EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF ANNEXIN A7 IN GASTRIC CANCER

ZHANG Yang, XU Qian, CHEN Long, et al
(Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China)

Objective:To investigate the expression and significance of Annexin A7 in human gastric cancer.Methods:SP immunohistochemical staining and Western Blotting were respectively used to detect the expression of Annexin A7 in 55 cases gastric cancer and 25 cases para-carcinoma normal gastric tissue.Results:The Annexin A7 expression in gastric cancer was obviously higher than that in normal gastric tissue (P＜0.05).Conclusions:Annexin A7 may participate in the development of gastric cancer.

Annnexin A7; Gastric cancer; Tumor

R735.2

A

1004-6879(2014)03-0193-03

2013-10-10)

△ 通訊作者