董凱峰 呂 欣 宋冬梅 劉志明 薛海濤 張翠紅

喉鱗癌是臨床較常見、病情發(fā)展迅速且治愈率較低的惡性腫瘤之一。探討喉鱗癌增殖、侵襲的機制，尋找影響喉鱗癌治療效果的相關(guān)基因，對臨床治療喉鱗癌具有重要意義。賴氨酰氧化酶（lysyl oxi?dase,LOX）屬于糖蛋白，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞外的膠原蛋白、結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白以及彈性蛋白賴氨酸源性交聯(lián)的產(chǎn)生[1]。較早的研究發(fā)現(xiàn)，LOX在一些癌組織中表達(dá)下調(diào)，能抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，具有抑制腫瘤的功能。但近期研究揭示，LOX對癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移具有明顯的促進(jìn)作用[2-3]。以上提示LOX可能具備抑制腫瘤和促進(jìn)轉(zhuǎn)移的雙重功能，但具體機制仍不清楚。RNA干擾具有高效性和高度特異性，其可阻斷真核細(xì)胞中相關(guān)基因產(chǎn)物的表達(dá)，是近年來基因組學(xué)研究的熱點。本研究通過阻斷人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞LOX mRNA及蛋白的表達(dá)，檢測其對LOX、增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67、PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表達(dá)，細(xì)胞凋亡及放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 喉鱗癌Hep-2細(xì)胞系購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物所。細(xì)胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清，青霉素0.1 μU/L，鏈霉素0.1 g/L，RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2 抗體及試劑 LOXsiRNA、LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購自CST公司；PI購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將Hep-2細(xì)胞分為3組，空白對照組（正常培養(yǎng)對照）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染試劑對照）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染LOXsiRNA）；同時按照小RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將Hep-2細(xì)胞以5×104/孔鋪于6孔板中，無血清無抗生素同步培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染試劑同細(xì)胞共孵育4～6 h后吸棄，加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Real-time PCR法檢測Hep-2細(xì)胞中的LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取50 ng總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR操作按照試劑盒說明進(jìn)行，基因引物見表1。每一樣品設(shè)3個復(fù)孔進(jìn)行擴增。條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，28次循環(huán)。讀取Ct值，計算3組的△Ct值=Ct目的基因–Ctβ-actin，△△Ct＝轉(zhuǎn)染組△Ct–空白對照組△Ct，以2-△△CT代表目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blot法測定Hep-2細(xì)胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 取Hep-2細(xì)胞總蛋白30 μg，與5×上樣緩沖液按4∶1混合，100℃煮10 min，與蛋白質(zhì)Marker一起上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE分離膠電泳，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBS配制5%的脫脂奶粉溶液封閉1.5 h，抗體 1∶500 4℃孵育過夜，1×TBST溶液洗滌3次，每次10 min，PVDF膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h后，1×TBST溶液洗滌3次，每次10 min，ECL顯色。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 MTT法檢測不同劑量射線對Hep-2細(xì)胞生存率的影響 對數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞接種至96孔板，分別給予不同劑量X射線（0、3、6、9、12、15、18 Gy）照射24 h后收取細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，每孔加入10 μL MTT(5 g/L，無血清RPMI 1640配制后過濾除菌)37℃培養(yǎng)4 h后終止，每孔加入DMSO 2 000 μL，微板儀振蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測490 nm各組吸光度（A）值。細(xì)胞生存率=（A轉(zhuǎn)染組-A空白對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）。

Table 1 The primer sequences of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9,LOX and β-actin gene表1 PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX和β-actin基因引物序列

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將Hep-2細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染組、放療組、轉(zhuǎn)染+放療組。轉(zhuǎn)染方法同1.2.1。放療組為給予劑量為12 Gy X射線照射細(xì)胞；轉(zhuǎn)染+放療組為轉(zhuǎn)染12 h后，給予12 Gy X射線照射細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞；1 000 r/min離心5 min，棄去上清；4℃預(yù)冷PBS洗2遍，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入70%冰乙醇重懸固定，-20℃保存；上機前1 000 r/min離心5 min，棄乙醇，4℃預(yù)冷PBS洗3次；4℃預(yù)冷500 μL PBS制成細(xì)胞懸液，加RNaseA消化(終濃度50 mg/L)，4℃放置1 h，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL，加入0.1 g/L PI 500 μL，避光20 min，1 000 r/min離心5 min，4℃預(yù)冷PBS重懸，上機檢測細(xì)胞凋亡，每個樣本檢測1×104個細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，多樣本均數(shù)比較采用F檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染LOXsiRNA對Hep-2細(xì)胞PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和LOX mRNA及蛋白表達(dá)水平較陰性對照組和空白對照組明顯下調(diào)(P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、3，圖1。

2.2 不同劑量的X射線對Hep-2細(xì)胞生存率的影響 不同劑量（0、3、6、9、12、15、18 Gy）X射線作用Hep-2細(xì)胞24 h，細(xì)胞生存率分別為(99.12±1.42)%、(90.32±1.32)%、(81.20±2.11)%、(73.35±1.23)%、(54.13±1.25)%、(51.26±2.42)%、(50.13±2.12)%，呈逐漸下降趨勢(F=20.126，P＜0.05)，劑量為12、15、18 Gy時，細(xì)胞生存率明顯低于劑量為9 Gy時，但3種劑量（12、15、18 Gy）組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

Table 2 Comparison of relative mRNA expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表2各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

＊P＜0.05；a與轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

PCNA Ki-67組別

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

Table 3 Comparison of relative protein expression of PCNA,Ki-67,MMP-2,MMP-9 and LOX between three groups表3各組PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、LOX蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

＊P＜0.05；a與轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組F PCNA 60.21±1.99a 55.14±0.91a 21.22±0.31 22.186＊Ki-67 59.32±2.11a 50.31±1.61a 22.13±0.12 36.391＊組別空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組F MMP-2 55.31±0.32a 53.22±0.87a 19.31±0.21 24.249＊MMP-9 54.43±0.67a 50.02±0.43a 21.41±0.54 30.173＊LOX 51.12±1.21a 49.11±1.31a 20.30±0.21 24.197＊

Figure 1 Results of Western blot analysis for protein expressions of LOX,Ki-67,PCNA,MMP-2 and MMP-9 in three groups of transfected Hep-2 cells圖1 Western blot法分析3組Hep-2細(xì)胞LOX、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果

Figure 2 The survival ratio of Hep-2 cells after different doses of radiation圖2 不同劑量射線作用24 h對Hep-2細(xì)胞生存率的影響

2.3 轉(zhuǎn)染LOXsiRNA對Hep-2細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響 5組細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 10.267，P＜0.05）。轉(zhuǎn)染組（16.21±1.17）明顯高于陰性對照組（4.95±1.12）和空白對照組(5.01±1.02)，空白對照組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染+放療組（79.11±1.26）明顯高于陰性對照組、空白對照組、放療組（43.21±2.12）及轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

喉鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要因素，在這個過程中，許多腫瘤相關(guān)的增殖轉(zhuǎn)移基因參與調(diào)控，如Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9，而最近的研究揭示，LOX對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移存在明顯的促進(jìn)作用，LOX的生物學(xué)功能是作用于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的膠原和彈性纖維，催化產(chǎn)生一系列復(fù)雜反應(yīng)，最終形成膠原與彈性纖維間的共價交聯(lián)[4]，即通過此共價交聯(lián)，發(fā)揮維持基底膜完整性，LOX的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)在保持ECM的發(fā)育、成熟及結(jié)構(gòu)的完整性方面起重要作用[5-6]。Erler等[2]研究指出LOX由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α調(diào)控，與人類乳腺及頭頸部腫瘤的缺氧有關(guān)。抑制LOX能降低原位乳腺癌在荷瘤小鼠模型中的轉(zhuǎn)移，而腫瘤細(xì)胞自身可通過黏著斑激酶(focaladhesin kinase,FAK)的活性及細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，同時分泌LOX，可誘導(dǎo)缺氧環(huán)境下的人類癌細(xì)胞的侵襲。該研究還證明，缺氧環(huán)境下LOX mRNA及蛋白的含量明顯增加，并且已分泌的LOX活性明顯提高，從而促進(jìn)了細(xì)胞侵襲性遷移，利于腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散。另外，由于LOX活性的增加及細(xì)胞的遷移導(dǎo)致ECM的軌跡被改變，提供了一條直接通路，使后續(xù)的細(xì)胞更易于移動，因此增加了細(xì)胞的遷移和侵襲[7-8]。

為進(jìn)一步探討LOX在喉鱗癌中可能發(fā)揮的作用，本研究采用RNA干擾技術(shù)，將LOX siRNA轉(zhuǎn)染至喉鱗癌Hep-2細(xì)胞，觀察LOX基因?qū)眵[癌Hep-2細(xì)胞生長、凋亡以及增殖侵襲相關(guān)蛋白Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的LOX mRNA和蛋白表達(dá)受到顯著抑制，表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和空白對照組，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于陰性及空白對照組，說明LOX表達(dá)越低，Hep-2細(xì)胞凋亡指數(shù)越高。另外，本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LOX siRNA后，Ki-67、PCNA蛋白的表達(dá)均明顯降低，提示可能因下調(diào)LOX基因而影響Ki-67、PCNA的表達(dá)，Ki-67、PCNA的表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，在G1期時表達(dá)增加，在S期時明顯表達(dá)，G2和M期達(dá)到峰值，在細(xì)胞有絲分裂后迅速下降，因此，Ki-67、PCNA被認(rèn)為是一個能可靠地反映細(xì)胞增殖活性的客觀指標(biāo)[9-11]。腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵問題是ECM成分的降解，而MMPs能降解ECM，在惡性腫瘤的浸潤和擴散中起重要作用。MMP-2是所有MMPs中分布最廣的，當(dāng)細(xì)胞惡變時，MMP-2常升高。MMP-9是MMPs中分子質(zhì)量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的ECM和基膜，使瘤細(xì)胞可沿著缺失的基膜向周圍組織浸潤，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；另一方面可通過促進(jìn)腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管新生，使腫瘤生長、擴散[12]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LOX siRNA后，Hep-2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯減弱，提示降低LOX表達(dá)可使這些相關(guān)基因的表達(dá)下降，以此來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，達(dá)到治療腫瘤的目的。然而相關(guān)基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段是如何相互影響的機制目前尚不清楚，可能與癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性不同有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

X射線導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個主要途徑是激活細(xì)胞的凋亡機制[13]。細(xì)胞凋亡是在基因控制下，通過主動的生化過程而發(fā)生自殺死亡的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡程序的修復(fù)可提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)劑量為12 Gy射線照射時，轉(zhuǎn)染聯(lián)合放療組Hep-2細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于陰性對照組、空白對照組、放療組及轉(zhuǎn)染組，提示LOX siRNA轉(zhuǎn)染后具有增強放療效果、抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，是增強放療敏感性的一個潛在的分子靶位點，有可能在不改變放療放射劑量前提下，增強放療效果，為以后在基因水平上改變腫瘤細(xì)胞的放療敏感性提供了線索。

[1] Langton AK,Griffiths CE,Sherratt MJ,et al.Cross-linking of struc?tural proteins in ageing skin:an in situ assay for the detection of amine oxidase activity[J].Biogerontology,2013,14(1):89-97.

[2] Erler JT,Bennewith KL,Nicolau M,et al.Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced Metastasis[J].Nature,2006,440(27):1222-1226.

[3]Erler JT,Giaccia AJ.Lysyl oxidase mediates hypoxic control of me?tastasis[J].Cancer Res,2006,66(21):10238-10241.

[4]Drzewiecki BA,Anumanthan G,Penn HA,et al.Modulation of the hypoxic response following partial bladder outlet obstruction[J].J Urol,2012,188(4):1549-1554.

[5]Tanaka T,Yamaguchi J,Shoji K,et al.Anthracycline inhibits recruit?ment of hypoxia-inducible transcription factors and suppresses tu?mor cell migration and cardiac angiogenic response in the host[J].J Biol Chem,2012,287(42):34866-34882.

[6]Kakkad SM,Solaiyappan M,O'Rourke B,et al.Hypoxic tumor mi?croenvironments reduce collagen I fiber density[J].Neoplasia,2010, 12(8):608-617.

[7]Pez F,Dayan F,Durivault J,et al.The HIF-1-inducible lysyl oxi?dase activates HIF-1 via the Akt pathway in a positive regulation loop and synergizes with HIF-1 in promoting tumor cell growth[J]. Cancer Res,2011,71(5):1647-1657.

[8]Scola N,G?r?gh T.LOXL4 as a selective molecular marker in prima?ry and metastatic head/neck carcinoma[J].Anticancer Res,2010, 30(11):4567-4571.

[9]Dzieniecka M,Krystosiak K,Kulig A.Immunoexpression of Ki-67 in pulmonary hypoplasia[J].Pol J Pathol,2013,64(2):109-113.

[10]Jesionek-Kupnicka D,Chomiczewska-Skóra D,Rotsztejn H.Influ?ence of phototherapy in psoriasis on ki-67 antigen expression:a preliminary study[J].Pol J Pathol，2013,64(2):96-103.

[11]Zhu XN,Kim DH,Lin HR,et al.Proteolysis of Xenopus Cip-type CDK inhibitor,p16Xic2,is regulated by PCNA binding and CDK2 phosphorylation[J].Cell Div,2013,22：8(1):5.

[12]Van Tubergen EA,Banerjee R,Liu M,et al.Inactivation or loss of TTP promotes invasionin head and neck cancervia transcript stabili?zation and secretion of MMP9,MMP2,and IL-6[J].Clin Cancer Res,2013,19(5):1169-1179.

[13]Zhu WG,Aramaki R,Cai Y,et al.Promotion of heat induced apop?tosis in FM 3A cells by protease inhibitions[J].Biochern Biophys Res Commun,2002,225:924-931.