劉圣明， 高續(xù)恒， 張艷慧， 李 夢， 梅笑寒

（河南科技大學(xué)林學(xué)院植物保護(hù)系，洛陽 471003）

灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botr ytis cinerea Pers．ex Fr．）引起的一種世界性的重要病害，可為害番茄、黃瓜、茄子、西葫蘆、草莓和葡萄等200多種作物，尤其在設(shè)施蔬菜上危害尤為嚴(yán)重［1－2］。灰霉病在番茄上發(fā)生嚴(yán)重時，造成番茄花、葉和果實的腐爛，影響產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時造成減產(chǎn)50%以上［3］。由于番茄種質(zhì)資源中缺少高抗灰霉病的品種，生產(chǎn)上主要使用苯并咪唑類殺菌劑多菌靈（carbendazi m，略寫為Ben）、二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利（procymidone，略寫為Dic）和氨基甲酸酯類殺菌劑乙霉威（diethofencarb，略寫為NPC）等藥劑防治，但由于灰霉病菌具有繁殖快、遺傳變異大和適合度高的特點，極易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性［4－6］。

多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑作用分子靶標(biāo)單一，具有選擇性強(qiáng)、高效、低毒的突出優(yōu)點，自20世紀(jì)60年代末期創(chuàng)制以來，一直被廣泛用于控制植物病害的流行和危害，是防治灰霉病應(yīng)用最早的一類內(nèi)吸性殺菌劑。此類藥劑使用2～3年后，1971年Bollen等研究發(fā)現(xiàn)灰霉病菌對苯菌靈產(chǎn)生了抗藥性［7］，1987年周明國等在我國南京市郊區(qū)檢測到灰霉病菌對多菌靈的抗藥性菌株［8］。腐霉利等二甲酰亞胺類殺菌劑是20世紀(jì)70年代初推出的一類廣譜性現(xiàn)代保護(hù)性殺菌劑，具有一定的局部治療作用，是繼苯并咪唑類殺菌劑之后防治灰霉病的又一類特效殺菌劑。Beever等早在1983年就檢測到灰霉病菌大田抗藥性菌株的存在［9］。乙霉威等氨基甲酸酯類殺菌劑是20世紀(jì)70年代中期以后發(fā)展起來的新型內(nèi)吸性殺菌劑。乙霉威與苯并咪唑類殺菌劑存在負(fù)交互抗性，使用初期防治蔬菜灰霉病效果顯著，但不久陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了既抗多菌靈又抗乙霉威的灰霉病菌菌株［10－11］。隨著多菌靈、腐霉利和乙霉威施藥次數(shù)和施藥量的不斷增加，我國江蘇、山西、遼寧和北京等地相繼出現(xiàn)了單抗、雙抗、甚至多抗的不同抗藥性類型的灰霉病菌菌株［3，12－15］。

到目前為止，河南省番茄灰霉病菌對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利和氨基甲酸酯類殺菌劑乙霉威的抗藥性發(fā)生狀況還未見報道。為了明確河南省番茄灰霉病菌對這3類殺菌劑的抗藥性狀況，作者從河南省不同保護(hù)地中采集、分離番茄灰霉病菌菌株，測定其對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性，為制定正確的防治灰霉病的策略及指導(dǎo)生產(chǎn)上合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 菌株的采集和分離

2013年1－3月從河南省鄭州市、洛陽市、開封市、新鄉(xiāng)市和許昌市不同保護(hù)地中采集番茄灰霉病病果或病葉，采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）單孢分離獲得灰霉病菌菌株139株（表1），用斜面培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中備用。

表1 供試番茄灰霉病菌菌株及其來源Table 1 Isolates and their sources of Botr ytis cinerea in this study

1．2 供試藥劑

97%多菌靈原藥（江蘇省鎮(zhèn)江農(nóng)藥廠提供），預(yù)溶于0．1 mol／L鹽酸配成10 mg／mL母液；

98%腐霉利原藥（日本住友公司提供），預(yù)溶于丙酮，配制成10 mg／mL母液；

97．4%乙霉威原藥（江蘇省新沂農(nóng)藥有限公司提供），預(yù)溶于甲醇，配制成10 mg／mL母液。

1．3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g，加蒸餾水至1 000 mL。

1．4 含藥培養(yǎng)基制備

將多菌靈、腐霉利和乙霉威母液系列稀釋，按一定的比例分別加入到PDA培養(yǎng)基中，制成含多菌靈5μg／mL的PDA平板、含腐霉利5μg／mL的PDA平板和含乙霉威1μg／mL的PDA平板（在培養(yǎng)基滅菌后，溫度降到45℃左右時加入藥劑）。

1．5 灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗性檢測

采用最低抑制濃度法（MIC）檢測番茄灰霉病菌對各藥劑的抗藥性。多菌靈和腐霉利鑒別濃度為5μg／mL，乙霉威的鑒別濃度為1μg／mL［14－17］。將待檢測的灰霉病菌各菌株接種到PDA平皿上，23℃條件下培養(yǎng)3 d后，用打孔器在菌落邊緣打出直徑為5 mm的菌餅，然后用接種針挑取菌餅分別接種于多菌靈5μg／mL、腐霉利5μg／mL、乙霉威1μg／mL的含藥平板上。23℃下培養(yǎng)3 d，觀察生長情況，不能在該鑒別濃度上正常生長的菌株為敏感菌株，能正常生長的菌株為抗性菌株。統(tǒng)計各地區(qū)的敏感和抗性菌株的發(fā)生頻率。

2 結(jié)果與分析

2．1 河南省番茄灰霉病菌的抗性頻率及分布

2013年在河南省番茄灰霉病發(fā)生較為嚴(yán)重的不同保護(hù)地中采集番茄灰霉病病果或病葉，經(jīng)單孢分離共獲得灰霉病菌139株，其中，鄭州33株，洛陽24株，開封25株，新鄉(xiāng)26株，許昌31株。采用最低抑制濃度法（MIC）測定各菌株對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性。結(jié)果顯示（表2），多菌靈敏感菌株26株，抗性菌株113株；腐霉利敏感菌株27株；抗性菌株112株；乙霉威敏感菌株9株，抗性菌株130株；對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗性頻率分別為81．29%、80．58%和93．53%。表明河南省番茄灰霉病菌已對多菌靈、腐霉利和乙霉威產(chǎn)生抗藥性。

表2 河南省番茄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性1）Table 2 Resistances of B．cinerea on tomato in Henan to carbendazim，procy midone and diethofencarb

從5個地區(qū)的測試結(jié)果可知（表2），許昌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗性頻率最高，分別為96．77%、100%和96．77%；新鄉(xiāng)對多菌靈抗性頻率最低，為69．23%；鄭州對腐霉利和乙霉威的抗性頻率最低，分別為60．61%和87．88%。表明各地區(qū)對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性程度不同。

2．2 河南省番茄灰霉病菌抗性類型

2013年采集的139株番茄灰霉病菌菌株，根據(jù)它們對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗、感性程度，可以分為BenRDicSNPCS（對多菌靈表現(xiàn)抗藥性，對腐霉利、乙霉威表現(xiàn)敏感）、BenRDicRNPCS（對多菌靈、腐霉利表現(xiàn)抗藥性，對乙霉威表現(xiàn)敏感）、BenRDicSNPCR（對多菌靈、乙霉威表現(xiàn)抗藥性，對腐霉利表現(xiàn)敏感）、BenSDicRNPCR（對腐霉利、乙霉威表現(xiàn)抗藥性，對多菌靈表現(xiàn)敏感）、BenSDicSNPCR（對乙霉威表現(xiàn)抗藥性，對腐霉利和多菌靈表現(xiàn)敏感）和BenRDicRNPCR（對多菌靈、腐霉利和乙霉威均表現(xiàn)抗藥性）6種表現(xiàn)型（表3）。BenRDicSNPCS類型的菌株有4株，所占比例為2．88%；BenRDicRNPCS和BenRDicSNPCR類型的菌株均有5株，各占3．60%；BenSDicRNPCR類型的菌株有7株，占5．04%；BenSDicSNPCR類型的菌株有19株，占13．67%；BenRDicRNPCR類型的菌株有99株，占71．22%。表明河南省番茄灰霉病菌對3種殺菌劑的表現(xiàn)型以BenRDicRNPCR類型為主，各地區(qū)在番茄灰霉病防治上，已連續(xù)多年普遍使用多菌靈、腐霉利和乙霉威，灰霉病菌已對這3種藥劑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性。

表3 河南省番茄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性表現(xiàn)型Table 3 Resistance types of B．cinerea on tomato in Henan to car bendazi m，procymidone and diethofencar b

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果顯示，河南省番茄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗性頻率分別為81．29%、80．58%和93．53%，表明河南省番茄灰霉病菌已對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利和氨基甲酸酯類殺菌劑乙霉威產(chǎn)生抗藥性，繼續(xù)單純用多菌靈、腐霉利或乙霉威防治灰霉病已起不到應(yīng)有的防治作用。苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰亞胺類殺菌劑和氨基甲酸酯類殺菌都屬于現(xiàn)代選擇性殺菌劑，作用分子靶標(biāo)單一，具有選擇性強(qiáng)、高效、低毒的突出優(yōu)點，但是灰霉病菌繁殖快、遺傳變異大、適合度高，隨著施藥次數(shù)和施藥量的不斷增加，藥劑選擇壓力不斷提高，極易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性［4－6］。王建新等在小麥赤霉病菌對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈的抗藥性研究中證實了藥劑選擇壓力的提高有利于病原菌抗藥性亞群體的快速發(fā)展［18］。目前，河南省各地區(qū)主要采用多菌靈、腐霉利和乙霉威防治番茄灰霉病，在灰霉病發(fā)生前期或初期開始使用，用藥有效劑量40～60 g／667 m2，5～7 d用藥1次，用藥3～5次（數(shù)據(jù)未發(fā)表），藥劑使用時間較長，施藥次數(shù)較多，施藥量較大，造成藥劑的選擇壓力較大，致使灰霉病菌抗藥性亞群體發(fā)生流行，對各藥劑的抗性頻率較高，與研究結(jié)果相符。5個地區(qū)的番茄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗藥性表現(xiàn)不同，主要是由于各地用藥歷史和用藥水平不同。

2011年喬廣行等研究發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)的灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的表現(xiàn)型有BenRDicSNPCS、BenRDicSNPCR、BenSDicSNPCR和 BenRDicRNPCR4種表現(xiàn)型，以BenRDicRNPCR類型為主，所占比例為56．22%［3］。本研究結(jié)果顯示，河南省番茄灰霉病菌對3種藥劑的表現(xiàn)型有BenRDicSNPCS、BenRDicRNPCS、BenRDicSNPCR、BenSDicRNPCR、BenSDicSNPCR和BenRDicRNPCR6種，以BenRDicRNPCR類型為主，所占比例為71．22%，表明河南省番茄灰霉病的抗藥性水平明顯高于北京地區(qū)，目前不宜通過多菌靈、腐霉利和乙霉威混用來防治番茄灰霉病，否則，多抗菌株在藥劑選擇壓力下可能迅速上升為優(yōu)勢群體，使得混用藥劑失去防效。

為了延緩抗藥性的進(jìn)一步加劇，延長藥劑的使用壽命，應(yīng)科學(xué)選用合適的殺菌劑防治灰霉病。由于嘧霉胺、咯菌腈、氟啶胺與多菌靈、腐霉利和乙霉威無交互抗性［19－20］，因此在抗性較嚴(yán)重的地區(qū)，可考慮選擇嘧霉胺、咯菌腈和氟啶胺進(jìn)行灰霉病菌對3類藥劑抗性的治理，以有效防治灰霉病。同時應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)業(yè)管理措施，做好抗性監(jiān)測，避免單一殺菌劑的連續(xù)使用，加強(qiáng)生物生態(tài)控制技術(shù)的研究。

［1］ Baptista F J，Bailey B J，Meneses J F．Effectof nocturnal ventilation on the occurrence of Botr ytis cinerea in mediterranean unheated to mato greenhouses［J］．Crop Pr otection，2012，32：144－149．

［2］ Williamson B，Tudzynski B，Tudzynski P，et al．Botr ytis cinerea：the cause of grey mould disease ［J］．Molecular Plant Pathology，2007，8：561－580．

［3］ 喬廣行，嚴(yán)紅，么奕清，等．北京地區(qū)番茄灰霉病菌的多重抗藥性檢測［J］．植物保護(hù)，2011，37（5）：176－180．

［4］ Malandrakis A，Mar koglou A，Ziogas B．Molecular character－ization of benzi midazole－resistant B．cinerea field isolates with reduced or enhanced sensitivity to zoxamide and diethofencarb［J］．Pesticide Biochemistry and Physiology，2011，99：118－124．

［5］ Jiang J H，Ding L S，Michailides T J，et al．Molecular characterization of field azoxystrobin－resistant isolates of Botrytis cinerea ［J］．Pesticide Biochemistry and Physiology，2009，93：72－76．

［6］ Shinpei B，F(xiàn)u miyasu F，Akihiko I，et al．Genotyping of benzi midazole－resistant and dicar boxi mide－resistant mutations in Botr ytis cinerea using real－ti me poly merase chain reaction assays［J］．Phytopat hology，2008，98：397－404．

［7］ Bollen G J，Scholten G．Acquired resistance to beno myl and so me other systemic f ungicides in a strain of Botr ytis cinerea in cyclamen［J］．Netherlands Journal of Plant Pathology，1971，77：83－90．

［8］ 周明國，葉鐘音，劉經(jīng)芬．南京市郊灰霉菌對苯并咪唑類殺菌劑田間抗性的檢測［J］．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1987，10（2）：53－57．

［9］ Beever R E，Brien H M R．A sur vey of resistance to the dicarboxi mide f ungicides in Botr ytis cinerea［J］．New Zealand Journal of Agricult ural Research，1983，26：391－400．

［10］Katan T，Eald Y，Yunis H．Resistance to diet hofencar b（NPC）in benomyl－resistant field isolates of Botr ytis cinerea［J］．Plant Pat hology，1989，38：86－92．

［11］Faretra F，Pollastro S．Genetics of sexual compatibility and resistance to benzi midazole and dicar boxi mide f ungicides in isolates of Botr yotinia f uckeliana （Botr ytis cinerea）from so me countries［J］．Plant Pat hology，1993，42（1）：42－48．

［12］潘以樓，朱桂梅，郭建．江蘇草莓灰霉病菌對5種殺菌劑的抗藥性［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（2）：299－304．

［13］韓巨才，劉慧平，閆秀琴，等．灰霉病菌對三種殺菌劑的抗性表現(xiàn)型分布及穩(wěn)定性測定［J］．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2004，6（3）：43－47．

［14］紀(jì)明山，程根武，張益先，等．灰霉病菌對多菌靈和乙霉威抗性研究［J］．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，29（3）：213－216．

［15］宋晰，肖露，林東，等．番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性檢測及生物學(xué)性狀研究［J］．農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2013，15（4）：398－404．

［16］張永杰，閆秀琴，韓巨才，等．山西省灰霉病菌對乙霉威的抗性監(jiān)測［J］．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，23（4）：308－310．

［17］Sun H Y，Wang H C，Chen Y，et al．Multiple resistance of Botr ytis cinerea from vegetable crops to carbendazi m，diet hofencar b，procy midone，and pyri met hanil in China［J］．Plant Disease，2010，94：551－556．

［18］王建新，周明國，陸悅健，等．小麥赤霉病菌抗藥性群體動態(tài)及其治理藥劑［J］．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，25（1）：43－47．

［19］喬廣行，林秀敏，黃金寶，等．8種殺菌劑對番茄灰霉病菌多重抗藥性菌株生物活性測定［J］．農(nóng)藥，2013，52（1）：57－59．

［20］陳治芳，王文橋，韓秀英，等．灰葡萄孢（Botr ytis cinerea）對氟啶胺的敏感基線及對不同殺菌劑的交互抗性［J］．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（3）：33－36．