田玉旺，許春偉，王東陽，陳 曦

導流雜交基因芯片技術在女性生殖道人乳頭狀瘤病毒檢測中的應用價值

田玉旺，許春偉，王東陽，陳 曦

目的評價導流雜交基因芯片技術在女性生殖道人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染檢測中的應用價值，探討女性生殖道感染最常見的HPV基因型及好發(fā)年齡。方法 采用導流雜交基因芯片技術對545例患者的宮頸細胞學標本進行宮頸細胞21種HPV-DNA基因分型檢測。比較細胞學正常組(n=120)、細胞學異常組(n=425)及細胞學異常各類型［宮頸慢性炎癥174例、宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ級102例、CINⅡ級74例、CINⅢ級36例、宮頸癌16例和尖銳濕疣23例］組HPV陽性率。將細胞學異常組分為4個年齡組:20～歲組85例、31～歲組140例、41～歲組90例、51～歲組110例，比較各年齡組HPV陽性率。結果 細胞學正常組HPV陽性率為22．5%(27/120)，細胞學異常組為87．3%(371/425)。細胞學異常組及細胞學異常類型6組HPV陽性率分別與細胞學正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。細胞學正常組中6種最為常見的HPV基因型按陽性率遞減依次為HPV16、68、18、52、58、11;細胞學異常組中6種最常見的HPV基因型依次為HPV 16、52、58、18、33、31。31～歲組、41～歲組HPV陽性率顯著高于51～歲組(P＜0.01)，31～歲組HPV陽性率最高，41歲后隨年齡的增長逐漸降低。結論 采用導流雜交基因芯片技術一次試驗能聯(lián)合檢測出多種HPV亞型感染及型別分布，從而提高由HPV感染引起的婦科腫瘤的防治水平。

基因芯片技術;乳頭狀瘤病毒感染;宮頸疾病;DNA指紋法

宮頸癌是目前常見的婦科惡性腫瘤之一，在全球婦女癌癥病死率中居第2位，人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染已被公認為是引起宮頸癌及其癌前病變的主要原因，幾乎所有的宮頸癌細胞中均可檢測到HPV-DNA的存在。HPVDNA檢測已成為宮頸癌篩查的重要方法之一。HPV是一組DNA病毒，可引起人類上皮細胞增生及乳頭狀瘤樣改變。在已知的100多種HPV亞型當中，有30余種亞型可以感染人的生殖器官［1］。HPV感染具有很強的地域性，在不同國家和地區(qū)其陽性率及其型別分布存在著較大的差別。因此，準確檢測宮頸病變患者HPV陽性率及其型別，有助于為宮頸病變的防治提供重要依據(jù)。本研究采用導流雜交基因芯片技術對545例行宮頸液基細胞學檢查的女性患者進行HPV-DNA檢測，以探討HPV感染與宮頸病變的關系及其型別分布特點。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2011年10月—2012年10月自北京軍區(qū)總醫(yī)院婦科門診行宮頸液基細胞學檢查的患者中選取545份標本，采集標本的患者年齡20～73歲，平均36．5歲。其中宮頸細胞學檢查正常者120例(細胞學正常組)，異常者425例(細胞學異常組)，對細胞學異常組均行宮頸活檢，按組織病理學分組:宮頸慢性炎癥組174例、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級組102例、CINⅡ級組74例、CINⅢ級組36例、宮頸癌組16例和尖銳濕疣組23例。將細胞學異常組分為4個年齡組:20～歲組85例，31～歲組140例，41～歲組90例，51～歲組110例。

1.2 主要儀器與試劑 醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、KP-TC48型PCR基因擴增儀和HPV基因分型檢測試劑盒均由潮州凱普生物化學有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集:將專用宮頸刷緊貼宮頸口黏膜，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉5圈，取得宮頸分泌物或脫落細胞，將取樣后的宮頸刷放入標有患者編號加專用細胞保存液的取樣管中，擰緊瓶蓋立即送病理科檢測。不能在24 h內檢測的樣本置－4℃冰箱保存，2周內進行檢測。

1.3.2 導流雜交法檢測HPV基因型:①樣本DNA分離 提 取:吸 取 送 檢 標 本 0．5 ml，離 心(13 000 r/min)15 min，棄上清液，用核酸提取試劑盒抽提DNA;②PCR擴增:將PCR Mix及DNA Taq酶按比例混合后，每支反應管加入24μl，再加入DNA模板1μl，混合后進行PCR擴增;③分子導流雜交:在雜交平臺上放入標記寡核苷酸探針的低密度基因芯片，一次可同時檢測15個臨床樣本，按試劑盒說明書進行導流雜交;④酶標顯色:導流雜交法一次可檢測 6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304 21 種 HPV基因型。

1.3.3 陽性結果判定標準:用肉眼觀察檢測結果，陽性點呈現(xiàn)清晰可見的藍紫色圓點，根據(jù)導流雜交膜HPV各基因亞型位點分布示意圖(圖1)判斷陽性點HPV病毒類型。每張雜交膜上設有Biotin對照點和內對照點(inner control，IC)各1個，Biotin點為雜交反應質控點，雜交失敗時不顯示，IC為PCR反應質控點，PCR反應失敗時不顯示。若上述兩對照點為陽性，其他點為陰性，應判定HPV分型DNA檢測結果為陰性;如果有1個或1個以上HPV分型點為陽性，代表該類型HPV檢測陽性，結果為單一或混合HPV感染。

圖1 導流雜交膜人乳頭狀瘤病毒各基因亞型位點分布示意圖

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10．0軟件進行統(tǒng)計學分析。不同組別HPV陽性率差異采用χ2檢驗，對多重感染患者，各基因型HPV陽性率重復計算。α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 HPV檢出概況 細胞學正常組HPV陽性率為22．5%(27/120)，細胞學異常組陽性率為87．3%(371/425)。細胞學異常組及細胞學異常類型6組HPV陽性率分別與細胞學正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 545例宮頸篩查患者HPV-DNA檢測結果

2.2 HPV-DNA分型檢測結果 在細胞學正常組及異常組中不同類型組，HPV各基因型的陽性率略有不同(表2)。細胞學正常組6種最為常見的HPV基因型按陽性率遞減依次為 HPV16、68、18、52、58、11;細胞學異常組6種最為常見的HPV基因型依次為 HPV16、52、58、18、33、31，其中慢性宮頸炎組組 6種最為常見的 HPV 基因型依次為16、18、58、52、31、53，CINⅠ級組依次為 58、16、52、18、33、68，CIN Ⅱ級組依次為 16、52、58、18、33、CP8304，CIN Ⅲ級組依次為 16、58、52、18、31、33;宮頸癌組依次為 16、18、52、58、33、66;尖銳濕疣組最常見的基因型為HPV11，其次是 HPV6，HPV18、16 和 53 型位居其后，HPV16和(或)18陽性者多數(shù)伴隨HPV11或6陽性。

在細胞學異常組6種最為常見的HPV基因型中，除CINⅠ級組外，HPV16在細胞學正常組及異常各組中均居第1位，且陽性率隨病變程度的加重明顯升高;HPV18陽性率隨病變程度的加重也呈升高趨勢，在CINⅠ級、Ⅱ級和Ⅲ級組中居第4位，但在宮頸癌組居第2位;HPV52、58陽性率隨病變程度的加重呈總體上升趨勢;HPV33陽性率隨病變程度的加重呈總體上升趨勢，在宮頸癌組居第5位;HPV31陽性率波動較大，雖然在CINⅠ級、Ⅱ級和Ⅲ級組隨病變程度的加重呈升高趨勢，但在宮頸癌組較低。

表2 HPV各基因型在細胞學正常組及異常組中的分布情況［陽性例數(shù)(%)］

2.3 細胞學異常組HPV陽性率與年齡的關系 20～歲組與51～歲組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，31～歲組、41～歲組HPV陽性率高于51～歲組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，31～歲組感染率最高，41歲后隨年齡的增長HPV陽性率逐漸降低，見表3。

表3 細胞學異常組HPV陽性與年齡的關系(n=425)

3 討論

研究顯示，HPV的持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的重要原因之一［2］，對HPV感染的檢測和分型是處理宮頸病變的重要依據(jù)，也是宮頸癌篩查中不可缺少的內容［3］。根據(jù)病毒致病力大小，HPV分為高危型和低危型，高危型HPV持續(xù)感染可導致CIN及宮頸癌。因此，近年來國內外婦產(chǎn)科專家建議對30歲及以上婦女進行HPV檢測及細胞學聯(lián)合的宮頸篩查［4］。目前實驗室檢測HPV亞型感染多采用斑點印跡法、熒光原位雜交法、Southern雜交法、聚合酶鏈反應(PCR)法、第2代雜交捕獲(hybrid capture 2，HC-2)法［5-6］及導流雜交基因芯片技術［7-10］。傳統(tǒng)的HPV分型方法操作較復雜、雜交效率低，目前臨床公認的HPV檢測方法當屬HC-2試驗，但其缺點是不能具體對HPV進行基因型分型，高危型和低危型不能同時檢測，不能判斷多重感染［11-12］。本文采用的導流雜交基因芯片技術是HPV基因型分型檢測的新方法，該方法集導流雜交及基因芯片技術于一身，分析通量大，能同時對21種HPV基因型進行快速分型檢測，包括5 種低危型:6、11、42、43、44，13 種高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，3 種中國人群常見感染亞型:53、66、CP8304。除HC-2能檢測的18種基因型外，還包括66、53、81基因型，檢測的型別更多且可判斷多重感染，彌補了HC-2等其他檢測方法的不足，是目前最前沿的HPV分型檢測手段。導流雜交的技術原理為:將探針固定于膜纖維中，使目標分子主動導流穿過固定有探針的薄膜并與互補探針相結合，形成復合物而被固定下來，未被結合固定的分子穿過薄膜后被除去，加速了互補分子之間的相互作用，將雜交時間從幾個小時降至幾分鐘，比傳統(tǒng)雜交法省時幾百倍。

本研究采用導流雜交基因芯片技術對545份宮頸細胞學標本進行了HPV-DNA分型檢測及分析，結果發(fā)現(xiàn)，細胞學正常組HPV陽性率為22．5%，細胞學異?；颊逪PV陽性率為87．3%，CIN及宮頸癌患者HPV陽性率明顯高于細胞學正常組，且隨宮頸病變程度的加重，HPV陽性率逐漸上升，宮頸癌組HPV陽性率為100.0%，與文獻報道一致［13-14］，說明HPV感染與宮頸病變嚴重程度密切關系，是導致宮頸癌前病變和宮頸癌的主要因素。

不同的地區(qū)HPV流行的基因型有所不同。有文獻報道，中國宮頸癌患者HPV16、18最常見，58和52 居第 3、4 位，再次為 31、33 和 45［15］;HPV52、58在上海地區(qū)宮頸癌患者中的陽性率甚至高于HPV16、18，且HPV52、58的陽性率南方地區(qū)較北方高［16］。本研究中，宮頸病變患者最常見的HPV基因型為 HPV16、18、52、58、33、31，與文獻報道一致［17］。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者最常見的感染基因型為 HPV16、18、45、31、33、58、52，亞洲地區(qū)的 HPV58、52 型的感染率遠高于 HPV45、31、33［18］，本文結果與報道相符。本研究中HPV43型的檢出率極低(0)，符合亞洲地區(qū)高危 HPV的流行狀況［7］。上述結果進一步證實，導流雜交基因芯片技術檢測HPV分型結果的可靠性。

有研究認為，HPV 的感染率與年齡有關［4，19］，HPV陽性率在25歲以前出現(xiàn)第1個高峰，隨后下降，在圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后出現(xiàn)第2個高峰［20］。還有學者認為，HPV感染與性行為密切相關，主要包括較早年齡初次性行為、性伴侶數(shù)和性伴侶的性行為等因素［21］。目前認為，HPV感染的高危因素有性行為、年齡和吸煙等，HPV感染好發(fā)于18～30歲女性，但大多數(shù)為一過性的感染。若高危型HPV感染持續(xù)存在，則發(fā)生CIN與宮頸癌的風險將大大提高。本研究結果顯示，細胞學異常組31～歲、41～歲組HPV陽性率顯著高于51～歲組，31～歲組感染率最高，但41歲后隨著年齡的增長HPV陽性率逐漸降低。提示31～41歲年齡段是育齡女性宮頸病變HPV感染的高發(fā)期，對30歲以上育齡女性進行宮頸陰道細胞學檢查和HPV篩查意義更大。

總之，采用導流雜交基因芯片技術檢測HPVDNA具有較高的特異性、敏感性、有效性、重復性和靈敏度，對判斷疾病類型、進行治療后的隨訪及HPV流行狀況的分析都具有重要意義。

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Application Value of Flow-Through Hybridization with GeneChip Technique in Detection of the Human Papilloma Virus of Female Genital Tract

TIAN Yu-wang1，XU Chun-wei1，WANG Dong-yang2，CHEN Xi2(1．Departmentof Pathology，General Hospital of Beijing Military Area Command，Beijing 100700，China;2．Chaozhou Kaipu Biochemical Co．Ltd，Chaozhou，Guangdong 521000，China)

ObjectiveTo evaluate the clinical value of flow-through hybridization with genechip technology in detection of human papilloma virus(HPV)of female genital tract，and to explore themost common HPV genotypes and high nosogenic age．MethodsThe cervical cells of21 kinds of HPV genotyping assayswere performed for545 cervical cytology specimens using flow-through hybridization with genechip technology．The HPV-positive rateswere compared among normal cytology group(n=120)，abnormal cytology group(n=425)and abnormal types of abnormal cytology group 174 cases of chronic cervical inflammation，cervical intraepithelial neoplasia(102 cases of CIN I，74 cases of CIN IIand 36 cases of CIN III)，16 casesof cervical carcinoma and 23 cases of condyloma acuminatum］．Abnormal cytology group was divided into 4 age subgroups:85 cases of the 20－31 age group，140 cases of the 31－41 age group，90 cases of the 41－51 age group and 110 case of older than 51 age group，and HPV infection rates in the four groupswere compared．ResultsThe HPV － positive ratewas22．5%(27/120)in normal cytology group and 87．3%(371/425)in abnormal cytology group respectively．The differences in HPV-positive rates in abnormal cytology group and 6 subgroups in abnormal types of abnormal cytology group respectively compared with that in normal cytology group were statistically significant(P ＜0．01)．Six of the common HPV genotypes in normal cytology group were HPV16，68，18，52，58 and 11 in turn(by diminishing positive rate);six of themost common HPV genotypes in abnormal cytology group were HPV 16，52，58，18，33，31．The HPV-positive rates in the 31－41 age and the 41－51 age groupswere significantly higher than that in older than 51 age group(P＜0.01)，the31－41 age group had the highest HPV-positive rate，and the rate gradually decreased with age increasingwhen the patientswere 41 years old．ConclusionThe flow-through hybridization with genechip technologymay detecta variety of HPV infected subtypes and group types in justone test to improve the level of prevention and treatment of gynecologic cancer induced by HPV infection．

Genechip technology;Papillomavirus infection;Uterine cervical disease;DNA Fingerprinting

R319．9;R512．99

A

2095-140X(2014)05-0086-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．024

100700北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科(田玉旺、許春偉);521000廣東潮州，潮州凱普生物化學有限公司(王東陽、陳曦)

book=0,ebook=220

2014-02-21 修回時間:2014-03-15)

·論著·