程利娟，郭 琪，雷 虹，楊 瑩，申 睿，慕 磊，王彥宗

高效液相色譜法測(cè)定牛樟芝中腺苷的含量

程利娟，郭 琪，雷 虹，楊 瑩，申 睿，慕 磊，王彥宗

目的采用高效液相色譜法測(cè)定牛樟芝中腺苷的含量。方法 色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(4．6 mm ×250mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈 －0．01mol/L 磷酸二氫鉀溶液(6∶94)，流速:1．0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:10μl。結(jié)果 腺苷在2．696～67．40 g/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0．999 9)，平均回收率為99．89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．71%(n=6)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，為控制牛樟芝的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

牛樟芝;腺苷;色譜法，高效液相

牛樟芝(Antrodiacamphorata)又名牛樟菇、樟菇、樟芝、陰陽對(duì)口菇、靈芝之王、血靈芝、棺花，為臺(tái)灣地區(qū)特有真菌品種，具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗細(xì)菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護(hù)肝臟等生理活性，而且不良反應(yīng)很少［1-2］?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，牛樟芝含有三萜類化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有機(jī)鍺、蛋白質(zhì)(含免疫蛋白)、維生素、煙堿酸、麥角固醇等多種有效成分［3］。腺苷作為牛樟芝重要活性成分之一，能夠降低體外循環(huán)后肺缺血－再灌注損傷，有效改善右心功能，對(duì)再灌注心臟具有保護(hù)作用，同時(shí)提高血液供氧能力和加速血液微循環(huán)，提高血液對(duì)心腦的供氧能力［4-8］，是牛樟芝發(fā)揮藥理作用的主要成分之一，但目前尚未見以腺苷作為牛樟芝內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步嚴(yán)格控制中藥材的質(zhì)量，確保臨床用藥的有效性，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定牛樟芝中腺苷的含量，以期為牛樟芝的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀(包括四元泵，VWD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，ChemStation化學(xué)工作站);Mettler-Toledo AX205電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);KQ-300VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

腺苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110879-200202)，牛樟芝藥材(宏潮生物健康科技推廣中心，批號(hào):20121025，20121208，20130125)，甲醇、磷酸二氫鉀、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4．6 mm × 250 mm，5 μm)，流 動(dòng) 相:乙 腈 －0．01 mol/L磷酸二氫鉀溶液 (6∶94)，流速:1．0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:10 μl。

圖1 腺苷(A)和牛樟芝樣品(B)的高效液相色譜圖

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，腺苷色譜峰的理論塔板數(shù)＞10 000，分離度為2．95，拖尾因子為0．97，色譜圖見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備:精密稱取腺苷對(duì)照品13.48 mg，加15%甲醇定容至100 ml，制成濃度為134.8μg/m l的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 C冰箱保存。

2.3.2 供試品溶液制備:取牛樟芝粉末(過三號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用15%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、1.0、2.0、3.0、5.0 ml分別置于 10 ml量瓶中，加15%甲醇定容，搖勻，制成濃度分別為2.696、13.48、26.96、40.44、67.40 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=32.499X+0.1498(r=0.999 9，n=6)，表明腺苷在2.696～67.40μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為40.44μg/ml的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.58%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果腺苷峰面積的RSD為0.99%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品中腺苷平均含量為1.18 mg/g，RSD為0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率測(cè)定 精密稱取6份已知含量(1.18 mg/g)的牛樟芝樣品(批號(hào)20121025)0.1 g，分別精密加入40.44μg/ml的腺苷對(duì)照品溶液3.0 ml，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，測(cè)定腺苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 牛樟芝樣品腺苷含量及回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定 按“2．3．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定3批樣品的含量，每份樣品平行測(cè)定3份，結(jié)果腺苷的含量分別為 1．18、1．27、1．21 mg/g，RSD 分別為 0．97%、1.27%、1．14%。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 采用高效液相色譜法測(cè)定腺苷含量的報(bào)道較多，以甲醇－磷酸二氫鉀體系較多見，但是分析時(shí)間較長(zhǎng)［9-18］。參考其他文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)乙腈－磷酸二氫鉀體系也常用于腺苷含量的測(cè)定［19-23］。研究比較發(fā)現(xiàn)，乙腈－磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相體系的基線較甲醇－磷酸二氫鉀體系穩(wěn)定，通過比較乙腈－0．01 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈 －0．02 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈 －0．05 mol/L磷酸二氫鉀溶液等多種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈－0．01 mol/L磷酸二氫鉀溶液效果最好，而高比例磷酸鹽的存在可能對(duì)泵和色譜柱造成損害［24］。

3.2 色譜柱的選擇 通過對(duì)Agilent Zorbax SB-C18，Agilent Zorbax SB-C8，Agilent Eclipse XDB-C18多個(gè)不同填料色譜柱用于腺苷的分離效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色譜柱的分離效果最好，故選擇Agilent Zorbax SB-C18開展試驗(yàn)。

3.3 提取溶劑的選擇 通過比較甲醇、45%甲醇、15%甲醇、水4種不同提取溶劑對(duì)試驗(yàn)的影響發(fā)現(xiàn)，提取溶劑為15%甲醇時(shí)，腺苷的提取量較高，色譜圖中雜質(zhì)峰的影響較小，可能是由于牛樟芝中含有大量多糖成分，在使用甲醇處理時(shí)多糖和其他大分子物質(zhì)發(fā)生沉淀，情況得到改善，因此，選擇15%甲醇為提取溶劑。

人工栽培牛樟芝藥用價(jià)值較高，但價(jià)格昂貴，因此通過測(cè)定有效成分的含量，對(duì)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為重要，可進(jìn)一步保證和提高牛樟芝產(chǎn)品的質(zhì)量。

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High Performance Liquid Chromatography in Determ ination of Adenosine Content in Antrodia Cam phorata

CHENG Li-juan1，2，GUO Qi2，LEIHong2，YANG Ying2，SHEN Rui2，MU Lei2，WANG Yan-zong2(1．Department of Pharmacology，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei075000，China;2．Institute for Drug and Instrument Control，Combined Logistics Department of Beijing Military Area Command，Beijing 100071，China)

ObjectiveTo detect the Adenosine content in Antrodia Camphorata using high performance liquid chromatography(HPLC)．MethodsThe chromatographic column was Agilent Zorbax SB －C18column(4．6 mm ×250 mm，5 μm);the mobile phase was acetonitrile－0．01 mol·L－1KH2PO4solution(6∶94);the flow rate was 1．0 m l/min－1;the detection wavelengthwas260 nm;the column temperaturewas setat30 ℃;the injection volumewas 10 μl．ResultsA good linear relationship between the peak area and Adenosine concentration was observed within the range of 2．696 －67．40mg/ml(r=0．9999)．The average recoverywas99．89%with 1．71%of relative standard deviation(n=6)．ConclusionThismethod is accurate and has good sensitivity and reproducibility，and can provide scientific basis for controlling the quality of Antrodia camphorata．

Antrodia camphorata;Adenosine;Chromatography，high performance liquid

R927．11

A

2095-140X(2014)05-0076-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．021

軍隊(duì)中醫(yī)藥科研專項(xiàng)課題(10ZYZ204)

075000河北張家口，河北北方學(xué)院藥理教研室(程利娟);100071北京，北京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所(程利娟、郭琪、雷虹、楊瑩、申睿、慕磊、王彥宗)

王彥宗，E-mail:13701081036@139．com

2013-12-20 修回時(shí)間:2014-01-15)

·論著·