陳永艷，蔣麗娜，屈飛飛，劉衛(wèi)東

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100050；

2.北京市海淀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100094；3.北京食品科學(xué)研究院，北京 100050）

反相高效液相色譜法測(cè)定調(diào)味品中7種合成工業(yè)染料

陳永艷1,2，蔣麗娜3，屈飛飛2，劉衛(wèi)東2

（1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100050；

2.北京市海淀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100094；3.北京食品科學(xué)研究院，北京 100050）

建立測(cè)定調(diào)味品中7 種工業(yè)合成染料的高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取后，10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分析，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定。結(jié)果表明：7 種工業(yè)合成染料的分離效果良好，回收率為86.8%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～5.44% （n=5）；檢出限為0.2～0.5 mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于調(diào)味品中7 種工業(yè)合成染料的同時(shí)測(cè)定。

反相高效液相色譜；工業(yè)合成染料；調(diào)味品

自2003年5月法國(guó)首先發(fā)現(xiàn)了紅辣椒粉制品中蘇丹紅Ⅰ至今，食品中添加工業(yè)染料的違法事件層出不窮，食品安全備受關(guān)注，食品安全不僅僅關(guān)乎百姓的身體健康，更關(guān)系到社會(huì)的和諧發(fā)展。由于工業(yè)染料種類繁多，且不法商販把其添加到食品中，給食品日常監(jiān)管帶來(lái)較大困難，更給消費(fèi)者的健康帶來(lái)很大的危害。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅歸為三類致癌物，我國(guó)及歐盟等國(guó)家已禁止其作為食用色素。堿性橙具有致癌、致畸變性。根據(jù)美國(guó)衛(wèi)生研究所化學(xué)品健康與安全數(shù)據(jù)庫(kù)資料，攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會(huì)造成急性和慢性的中毒傷害，GB 2760—2007《食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，嚴(yán)禁將其作為食品添加劑使用。早在20世紀(jì)末，歐美、日本等國(guó)家和地區(qū)就己明令禁止將羅丹明B用于食品加工中，我國(guó)也將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第一批）》進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)管。但由于以上7 種工業(yè)燃料具有價(jià)格低廉、著色穩(wěn)定、色澤鮮艷等特點(diǎn)，在利益的驅(qū)動(dòng)之下，某些不法商販利用這些特點(diǎn)，將其作為色素用于食品生產(chǎn)與加工，給消費(fèi)者帶來(lái)潛在的危害和巨大的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立一套快速、準(zhǔn)確且可同時(shí)測(cè)定多種食品中非食用色素的測(cè)定方法具有重要意義，也可為日常監(jiān)管提供有力的技術(shù)保障。

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ為親脂性偶氮染料，其檢測(cè)方法多為電分析法[1-2]、熒光猝滅法[3]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[4]、液相色譜法[5-9]，堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、羅丹明B為親水性染料，由于其酸堿性不同，檢測(cè)方法通常包括熒光法[10-11]、液相色譜法[12-16]、液-質(zhì)聯(lián)用法[17]，目前液相色譜法較為普遍。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時(shí)測(cè)定幾十種工業(yè)染料[18-22]，雖然準(zhǔn)確度精密度高，但需要大型儀器設(shè)備，操作繁瑣，檢測(cè)成本較高，因而使用液相色譜法初篩更為普遍，簡(jiǎn)單快速。目前國(guó)標(biāo)方法尚不能實(shí)現(xiàn)對(duì)以上7 種工業(yè)染料同時(shí)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種簡(jiǎn)單快速、具有良好的重復(fù)性、檢出限的測(cè)定方法，為快速檢測(cè)各種調(diào)味品紅色系工業(yè)染料的方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉、辣椒醬、五香粉、花椒等 市售。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；二氯甲烷（色譜純）、乙酸銨（色譜純）；堿性橙（C.I.11270） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；酸性橙Ⅱ （純度87.0%）、羅丹明B（純度95.0%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；蘇丹紅Ⅰ（純度96.1%）、蘇丹紅Ⅱ（純度87.5%）、蘇丹紅 （純度91.2%）、蘇丹紅Ⅳ（純度82.5%） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10ATvp高效液相色譜系統(tǒng)（配有二極管陣列檢測(cè)器和CLASS-VP色譜工作站） 日本島津公司；Millipore純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；3K15離心機(jī)美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：X bridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸胺溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5.0 min，35%～60% A；5.0～10.0 min，60%～90% A；10.0～26.0 min，90%～90% A；26.0～30.0 min，90%～35% A。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻后超聲提取20 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中，殘?jiān)?0 mL乙腈再提取1次，合并上清液，定容至20 mL。提取液中加入2.5 mL水和約0.5 g氯化鈉，渦旋混勻后冷凍放置2 h，取出后10 000 r/min離心10 min，取乙腈層進(jìn)行液相色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別用純水溶解，乙腈定容配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L（按純度標(biāo)示折算）的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別用二氯甲烷溶解，乙腈定容配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L（按純度標(biāo)示折算）的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容得100 mg/L的7 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí)用流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 回收率實(shí)驗(yàn)

添加回收率實(shí)驗(yàn)樣品處理同1.3.2節(jié)，以辣椒粉為典型代表，在辣椒粉樣品中7 種被測(cè)物質(zhì)的添加量為2.5、5、10 mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，每種物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)有所區(qū)別；7種染料的最大吸收波長(zhǎng)在410～550 nm之間。為減少數(shù)據(jù)分析時(shí)間在兼顧靈敏度的前提下選擇適宜分析波長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用堿性橙Ⅱ在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定；酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ在485 nm下測(cè)定；蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定；羅丹明B在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

2.2 流動(dòng)相的選擇

蘇丹紅所需流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，一般為甲醇-水、乙腈-水。蘇丹紅水溶性低，為獲得適宜的柱效和保留時(shí)間，流動(dòng)相中有機(jī)相含量通常較高；酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ及羅丹明B親水性強(qiáng)，流動(dòng)相中乙酸銨對(duì)酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B分離影響較大。如圖1所示，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相中0、0.02、0.03 mol/L乙酸銨進(jìn)行對(duì)比，不添加乙酸銨不能改善目標(biāo)化合物峰形及分離，乙酸銨濃度過(guò)高在梯度洗脫中與高比例有機(jī)相易發(fā)生鹽結(jié)晶，損壞儀器。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選定0.02 mol/L為流動(dòng)相鹽濃度。

圖1 乙酸銨濃度對(duì)分離的影響Fig.1 Effect of ammonium acetate concentration on peak shape

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乙酸銨溶液中酸度變化對(duì)分離的影響進(jìn)行了研究，通過(guò)乙酸調(diào)節(jié)，在pH值為4.1、4.6、5.6進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B的保留時(shí)間會(huì)有所變化但均不影響分離，對(duì)蘇丹紅色系列無(wú)任何影響，為簡(jiǎn)化流動(dòng)相條件本實(shí)驗(yàn)選擇不調(diào)節(jié)pH值。

經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)考察，最終確定得到1.3.1節(jié)的色譜實(shí)驗(yàn)條件，在波長(zhǎng)485 nm條件下7 種工業(yè)染料的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 7 industrial synthetic dye standards

2.3 提取條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈、丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）作為提取液進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)辣椒粉、花椒粉進(jìn)行提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖3表明，3 種提取溶劑對(duì)堿性橙以外的6種工業(yè)染料提取效率沒(méi)有顯著性差異，乙腈對(duì)堿性橙的提取效果明顯優(yōu)于丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）的提取效果。為提高提取回收率，采用將20 mL乙腈分2次提取，每次10 mL，回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求，不再進(jìn)行第3次提取，以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。提取液中加入2.5 mL水和約0.5 g氯化鈉，將氯化鈉加入乙腈提取液中，增強(qiáng)離子化效應(yīng)，使乙腈與水分層，同時(shí)也使提取目標(biāo)物更完全地溶于乙腈中。

圖3 提取溶劑對(duì)不同染料回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on the average recoveries of industrial synthetic dyes

2.4 線性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.3節(jié)配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別作出堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、羅丹明B、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表 1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Linear regression equations and limits of detection of seven industrial synthetic dyes

2.5 方法的檢出限、回收率和精密度

表2 回收率實(shí)驗(yàn)（n =5）Table 2 Results of recovery tests (n == 55))

圖4 辣椒粉空白樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of blank sample of chili powder

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)調(diào)味品中蘇丹紅染料進(jìn)行3次添加回收率重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分別在陰性的辣椒樣品基質(zhì)中添加2.5、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg 3 種水平的7 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次。分別計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；以信噪比（RSN）大于3為方法檢出限，結(jié)果如表2所示。陰性的辣椒樣品譜圖及加標(biāo)水平為10 mg/kg的樣品加標(biāo)譜圖見(jiàn)圖4、5。

圖5 辣椒粉空白樣品加標(biāo)色譜圖Fig.5 Chromatogram of blank sample of chili powder spiked with 7 industrial synthetic dyes

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

本方法建立了同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中7 種工業(yè)染料的高效液相色譜法，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化，確定了色譜條件，7 種目標(biāo)物可完全達(dá)到基線分離。該方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于調(diào)味品中工業(yè)合成染料的檢測(cè)。收集了農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市銷售的辣椒粉、五香粉、花椒等20個(gè)調(diào)味品樣品采用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行7 種工業(yè)染料檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。圖6、7分別為花椒、五香粉的實(shí)際樣品測(cè)定譜圖。

圖6 花椒樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of Pericarpium Zanthoxyli

圖7 五香粉樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of five-spice powder

[1] 瞿萬(wàn)云, 胡衛(wèi)兵, 朱杰, 等. 蘇丹紅Ⅰ在納米WO3修飾電極上的伏安行為及測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(14): 125-128.

[2] MA Xingying, CHAO Mingyong, WANG Zhaoxia. Electrochemical determination of Sudan Ⅰ in food samples at graphene modified glassy carbon electrode based on the enhancement effect of sodium dodecyl sulphonate[J]. Analytical Methods, 2013, 138(2/3): 739-744.

[3] 朱少萍, 蔡炳鋒, 毛慧, 等. 蘇丹紅Ⅲ對(duì)肌紅蛋白的熒光猝滅及分子模擬研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(21): 165-168.

[4] 裘雪梅, 劉仁榮, 徐玲. 蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(18): 258-261.

[5] 王明月, 桂衛(wèi)星, 袁宏球. HPLC法測(cè)定咸蛋、皮蛋黃中的四種蘇丹紅染料[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(2): 193-195.

[6] 李吉平, 劉文森, 高宏偉, 等. HPLC紫外檢測(cè)法測(cè)定辣椒制蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ號(hào)含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8): 332-336.

[7] 吳銀良, 楊挺, 趙健, 等. 固相萃取高效液相色譜法測(cè)定辣椒油中蘇丹紅和對(duì)位紅染料[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16): 243-246.

[8] 林欽, 鄭小嚴(yán), 何樹坤, 等. 堿性橙Ⅱ染料快速檢測(cè)顯色劑篩選及顯色條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(20): 394-398.

[9] REBANE R, LEITO I, YURCHENKO S, et al. A review of analytical techniques for determination of SudanⅠ-Ⅳ dyes in food matrixes[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(17): 2747-2757.

[10] 梁宇, 黃世江, 王超海, 等. 熒光探針?lè)焖贆z測(cè)果汁中羅丹明B殘留量[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 258-260.

[11] 劉周憶, 朱拓, 顧恩東, 等. 熒光光譜檢測(cè)的酸性橙Ⅱ的研究[J]. 光學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(6): 1106-1110.

[12] 楊琳, 陳青俊, 梁晶晶, 等. 高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的堿性橙和堿性玫瑰精含量[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(24): 303-306.

[13] 林欽, 鄭小嚴(yán), 何樹坤, 等. 高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食品中的堿性橙、堿性嫩黃O和堿性桃紅T染料含量[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(14): 194-196.

[14] 徐琴, 劉琳, 傅余強(qiáng), 等. 高效液相色譜法測(cè)定食品中的酸性橙Ⅱ[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(8): 219-222.

[15] 李小燕, 李梅, 陳其鋒. 固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)葡萄酒中羅丹明B[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8): 238-243.

[16] 劉敏, 李小林, 別瑋, 等. 固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中15種工業(yè)合成染料[J]. 色譜, 2011, 29(4): 162-167.

[17] 劉宏華, 張利康, 武煒, 等. 微波萃取-凝膠滲透色譜-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腌豬肉中的羅丹明B殘留[J]. 肉類研究, 2012, 26(5): 30-33.

[18] 趙珊, 張晶, 楊奕. 超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)果汁和葡萄酒中的27種工業(yè)染料[J]. 色譜, 2010, 28(4): 356-362.

[19] 張東雷, 汪麗娜, 陳小珍, 等. 超快速液相色譜-離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中10 種堿性染料[J]. 色譜, 2012, 30(8): 770-776.

[20] 趙榕, 李兵, 趙海燕, 等. 固相萃取-超高效液相色譜串接四極桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定調(diào)味品中12 種工業(yè)染料[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2010, 22(4): 305-312.

[21] 路勇, 渠巖, 馮楠, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法快速篩查食品中的45種工業(yè)染料[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(6): 176-180.

[22] 郭新東, 冼燕萍, 羅海英, 等. 凝膠凈化/超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味醬中32 種工業(yè)染料[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2012, 31(6): 658-663.

Determination of Seven Industrial Synthetic Dyes in Condiments by RP-HPLC

CHEN Yong-yan1,2, JIANG Li-na3, QU Fei-fei2, LIU Wei-dong2
(1. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China; 2. Beijing Haidian District Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100094, China; 3. Beijing Academy of Food Science, Beijing 100050, China)

An HPLC method for the determination of seven industrial synthetic dyes in condiments was established. Samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic-assisted conditions and the extract was centrifuged. The supernatant was then analyzed by HPLC-DAD with gradient elution using a mobile phase consisting of 0.02 mol/L ammonium acetate and acetonitrile and quantified by an external standard method. The concentrations of seven industrial synthetic dyes showed good linearity with peak area, and good separation was achieved for them. Their recovery rates from a spiked sample were in the range of 86.8%–106.0%, and the relative standard deviations were 1.07%–5.44% (n = 5). The detection limits were in the range of 0.2–0.5 mg/kg. In conclusion, this method is rapid, simple, sensitive, accurate and reproducible, and has a good applicability to the simultaneous determination of seven industrial synthetic dyes in condiment products.

high performance liquid chromatography; condiment; industrial synthetic dyes

TS202.3

A

1002-6630（2014）06-0168-04

10.7506/spkx1002-6630-201406036

2013-08-23

陳永艷(1981—)，女，檢驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樾l(wèi)生檢驗(yàn)。E-mail：chenyongyan1934@163.com