申明月，劉玲玲，聶少平*，謝建華，李 昌，毛雪金，王遠(yuǎn)興，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

頂空-氣相色譜-四極桿質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)法測(cè) 定普洱茶香氣成分

申明月，劉玲玲，聶少平*，謝建華，李 昌，毛雪金，王遠(yuǎn)興，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

采用靜態(tài)頂空-氣相色譜-四極桿質(zhì)譜技術(shù)對(duì)普洱茶的香氣成分進(jìn)行分析，在利用NIST質(zhì)譜檢索庫(kù)檢索的基礎(chǔ)上，結(jié)合保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行定性，共鑒定出30 種香氣成分，同時(shí)運(yùn)用峰面積歸一化法測(cè)得各香氣組分的相對(duì)含量。結(jié)果表明：所測(cè)普洱茶香氣成分主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5類物質(zhì)，其中醇類化合物和酯類化合物的含量最高，分別占總香氣物質(zhì)成分的47.73%和40.97%。樣品中含量較高的6個(gè)化合物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.11%～6.59%之間，本法可為普洱茶香氣成分的分析提供參考。

普洱茶；香氣成分；保留指數(shù)；頂空分析；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

普洱茶是云南省特有的地方名茶，研究發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、減肥、抗動(dòng)脈硬化、防癌、抗氧化、防輻射等多種功效[1]。普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種鮮葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日曬等工序制成曬青毛茶，再經(jīng)渥堆、陳化及干燥等工序加工而成[2]。普洱茶按發(fā)酵工藝可分為生普和熟普2 個(gè)系列，型制上又可分為散茶和緊壓茶2 類[3]。普洱茶的香氣成分與普洱茶的品質(zhì)密切相關(guān)，也是目前市場(chǎng)上決定普洱茶價(jià)格的重要因子[4]。因此，普洱茶特征香氣成分的研究，一直是普洱茶研究工作者長(zhǎng)期關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。

目前普洱茶的香氣成分定性分析主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法，將各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖利用譜庫(kù)檢索，匹配度越高，定性的可靠性越高[4-5]。然而在實(shí)際的樣品分析過(guò)程中，會(huì)發(fā)現(xiàn)普洱茶的香氣成分往往含有多種同分異構(gòu)化合物，因結(jié)構(gòu)相似，質(zhì)譜圖差別也不大，采用常規(guī)質(zhì)譜檢索方法不易準(zhǔn)確定性，需要結(jié)合其他定性方法進(jìn)行鑒定。1958年Kovats首次提出保留指數(shù)（retention index，R I）的概念[6-7]；在Kovats方程中，保留指數(shù)以正構(gòu)烷烴同系物作為參考標(biāo)準(zhǔn)，所有與色譜保留行為有關(guān)的流體動(dòng)力學(xué)參數(shù)在Kovats方程中被消去。所以，保留指數(shù)與色譜分析的許多參數(shù)和條件無(wú)關(guān)，能在定性中減少甚至消除具體實(shí)驗(yàn)條件（如色譜柱、溫度、升溫條件、壓 力等）的干擾，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)頂空-氣相色譜-四極桿質(zhì)譜（headspace-gas chromatography-m ass spectrometry，HSGC-MS）技術(shù)對(duì)普洱茶的香氣成分進(jìn)行分析，在利用NIST質(zhì)譜檢索庫(kù)檢索的基礎(chǔ)上，結(jié)合保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行定性，并利用峰面積歸 一化法計(jì)算得到普洱茶各香氣成分的相對(duì)含量，結(jié)果顯示該定性分析策略和香氣成分檢測(cè)方法具有較大的優(yōu)越性，可為普洱茶香氣成分的分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

供試茶樣為昆明七彩云南慶灃祥茶葉股份有限公司生產(chǎn)的云南普洱茶（茉莉大葉曬青茶，緊壓茶），將普洱茶樣品按GB/T 8303—2002《茶：磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定》的要求粉碎，稱取5.00 g茶樣于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，壓緊瓶蓋，進(jìn)行HS-GC-MS檢測(cè)。正構(gòu)烷烴（C6～C10、C10～C20） 美國(guó)AccuStandard公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-7000B三重串聯(lián)四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有Agilent G1888A自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Masshunter工作站（Version B.03.01）工作站） 美國(guó)Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-GC-MS 分析條件

頂空條件[8]：進(jìn)樣環(huán)體積1 mL，樣品瓶加壓壓力10 psi，加壓時(shí)間0.5 min，充氣時(shí)間0.5 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min，進(jìn)樣環(huán)溫度110 ℃，傳輸線溫度130 ℃，樣品瓶的平衡溫度和平衡時(shí)間分別在60～100 ℃和15～40 min之間進(jìn)行優(yōu)化。

GC條件[9]：進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：1∶1；色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）毛細(xì)管色譜柱；升溫程序：起始溫度50 ℃，停留2 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），載氣流速：1 mL/min（恒流模式）。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子電離能量：70 eV；離子源、四極桿與傳輸線溫度分別為230、150、250 ℃；溶劑延遲：3 min；質(zhì)量掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500；質(zhì)譜數(shù)據(jù)運(yùn)用NIST 2008（Version 2.0 f）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行圖譜檢索。

1.3.2 普洱茶香氣成分保留指數(shù)的測(cè)定

單一線性程序升溫的條件下保留指數(shù)計(jì)算公式[6-7]：RI=100n＋100(TRx-TRn)/(TRn+1-TRn)；RI為待測(cè)組分的保留指數(shù)；TRx為待測(cè)組分的 保留時(shí)間；n 和n＋1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；TRn＜TRx＜TRn+1。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空平衡條件的優(yōu)化

將密封好的頂空瓶置于頂空進(jìn)樣器內(nèi)，分別設(shè)置樣品瓶的平衡溫度為60、70、80、90、100 ℃，平衡30 min后進(jìn)行測(cè)定。從圖1可看出，平衡溫度越高，普洱茶樣品釋放出來(lái)的香氣組分的數(shù)量與豐度都隨之增多，而當(dāng)平衡溫度高于90 ℃時(shí)測(cè)得的香氣組分的數(shù)量與豐度趨于穩(wěn)定。為避免普洱茶樣品加熱過(guò)度使一些性質(zhì)不穩(wěn)定的香氣組分發(fā)生熱分解、氧化等反應(yīng)從而產(chǎn)生新的成分，選擇頂空的平衡溫度為90 ℃。此外，在平衡溫度90 ℃的條件下，將頂空瓶密封好后分別平衡15、20、25、30、35、40 min，從圖2可以看出，當(dāng)平衡時(shí)間達(dá)到30 min后，測(cè)定結(jié)果趨于穩(wěn)定，因此選擇樣品的平衡時(shí)間為30 min。

圖1 頂空分析中樣品平衡溫度對(duì)主要香氣成分的影響Fig.1 Effect of headspace heating temperature on peak area of aroma components

圖2 頂空分析中樣品平衡時(shí)間對(duì)主要香氣成分的影響Fig.2 Effect of headspace heating time on peak area of aroma components

2.2 分析方法的精密度

6次平行測(cè)定普洱茶樣品中含量較高的6 個(gè)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：4.11%（芳樟醇）、5.39%（乙酸芐酯）、5.04%（己烯醇）、6.59%（乙酸葉醇酯）、6.27%（苯甲酸甲酯）、4.98%（6-莰烯酮）。化合物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，符合方法的要求。

2.3 普洱茶香氣成分檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)NIST 2008質(zhì)譜圖庫(kù)檢索結(jié)果，結(jié)合保留指數(shù)文獻(xiàn)值[10-26]對(duì)普洱茶香氣成分進(jìn)行了鑒定， 共得到30種化合物，同時(shí)運(yùn)用峰面積歸一化法測(cè)得各香氣組分的相對(duì)百分含量，結(jié)果詳見(jiàn)表1。由鑒定結(jié)果可知，普洱茶香氣成分十分復(fù)雜，并且相對(duì)含量差別也很大。通過(guò)比較分析普洱茶香氣成分，可以看出它們主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5 類物質(zhì)，其中醇類化合物有4 種，相對(duì)含量為47.73%；酯類化合物有6 種，相對(duì)含量為40.97%；酮類化合物有2 種，相對(duì)含量為6.23%；烴類化合物有16 種，相對(duì)含量為4.77%。在16種烴類化合物中大部分都是單萜烯類和倍半萜烯類物質(zhì)，其中單萜烯類物質(zhì)有4 種，相對(duì)含量為2.29%；倍半萜烯類物質(zhì)有9 種，相對(duì)含量為1.39%。普洱茶所含香氣組分相對(duì)含量超過(guò)3%的組分有6 種，依次為芳樟醇（36.71%）、乙酸芐酯（23.40%）、己烯醇（10.67%）、乙酸葉醇酯（7.96%）、苯甲酸甲酯（4.64%）、6-莰烯酮（3.99%）。

表 1 普洱茶香氣成分定性分析結(jié)果Table 1 Aroma components identified from Pu-erh tea

注：RI.通過(guò)文獻(xiàn)保留指數(shù)與實(shí)測(cè)保留指數(shù)比對(duì)定性；MS. 通過(guò)NIST質(zhì)譜庫(kù)檢索定性；RIexp.實(shí)測(cè)保留指數(shù)值；RIlit.文獻(xiàn)保留指數(shù)值。

3 結(jié) 論

普洱茶香 氣成分中含有多組同分異構(gòu)體，分子式為C10H16的組分有4 個(gè)（均為單萜烯），分子式為C15H24的組分有9個(gè)（均為倍半萜烯）。由于結(jié)構(gòu)相似，其在 NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜非常相似，因此僅依靠譜庫(kù)檢索結(jié)果來(lái)定性有可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。如圖3所示，峰8、9具有幾乎相同的質(zhì)譜圖，且譜圖直接檢索的結(jié)果皆為3-蒈烯；參考保留指數(shù)文獻(xiàn)值[17]可發(fā)現(xiàn)，3-蒈烯的保留指數(shù)為1 010，而峰8、9的保留指數(shù)分別為1 050和1 059，這說(shuō)明譜圖直接檢索的結(jié)果是不可靠的。此時(shí)將峰8、9的保留指數(shù)值與文獻(xiàn)[16-18]對(duì)比就很容易確定兩峰所對(duì)應(yīng)的化合物，即峰8應(yīng)為反式-β-羅勒烯，峰9應(yīng)為萜品烯。

圖3 峰8（A）與峰9（B）電子電離質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of Peak 8 (A) and Peak 9 (B)

采用保留指數(shù)結(jié)合NIST質(zhì)譜譜庫(kù)檢索對(duì)普洱茶香氣成分進(jìn)行了定性分析，共鑒定出30 種香氣成分，主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5 類物質(zhì)，同時(shí)運(yùn)用峰面積歸一化法測(cè)得各香氣組分的相對(duì)百分含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靜態(tài)頂空-氣相色譜-保留指數(shù)-質(zhì)譜分析是一種快速有效分析普洱茶香氣成分的方法，該分析策略彌補(bǔ)了常規(guī)GC-MS譜庫(kù)檢索定性方法的不足，大大提高了定性分析的準(zhǔn)確性和效率，使定性結(jié)果更加可靠。該定性分析思路應(yīng)用在其他復(fù)雜樣品揮發(fā)性成分檢測(cè)中也擁有巨大的潛力和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步研究推廣。

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Analysis of Aroma Components from Pu-erh Tea by Headspace-GC-MS Based on Retention Index

SHEN Ming-yue, LIU Ling-ling, NIE Shao-ping*, XIE Jian-hua, LI Chang, MAO Xue-jin, WANG Yuan-xing, XIE M ing-yong (State Key Laboratory of Food Science and Techonology, Nangchang University, Nangchang 330047, China)

A static headspace-gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS) method was used to analyze aroma components from Pu-erh tea. The separated peaks were identified by mass spectral library searching combined with retention index comparison. Thirty aroma components were identified from Pu-erh tea, mainly including alco hols (47.73%) and esters (40.97%). The precision expressed as relative standard deriva tion (RSD, n = 6) of the proposed method was in the range of 4.11%–6.59%. This method can be widely applied for the qualitative analysis of aroma components from Pu-erh tea.

Pu-erh tea; aroma components; retention index; headspace analysis; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

O656.2

A

1002-6630（2014）06-0103-04

10.7506/spkx1002-6630-201 406021

2013-10-12

教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（NCET-12-0749）；江西省 高等學(xué)?？萍悸涞赜?jì)劃項(xiàng)目（產(chǎn)學(xué)研合作）（KJLD13004）

申明月（1984—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析技術(shù)。E-mail：shenmingyue1107@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析、食品營(yíng)養(yǎng)與安全、糖化學(xué)與糖生物學(xué)。E-mail：spnie@ncu.edu.cn