邱 遠(yuǎn)，芮 昕，謝翌冬，李 偉，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取葛根素工藝

邱 遠(yuǎn)，芮 昕，謝翌冬，李 偉，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取葛根露酒中葛根素工藝。將葛根露酒進(jìn)行超聲波處理，縮短葛根露酒的浸泡時(shí)間，對(duì)超聲波工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)浸泡時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間3個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳的工藝參數(shù)條件為：浸泡時(shí)間22 h、超聲功率120 W、超聲時(shí)間12 min，此條件下的葛根素浸出量可達(dá)89.6 mg/g。

葛根；葛根素；葛根露酒；超聲波；響應(yīng)面法

葛根，又名野葛、甘葛、黃斤等，是豆科屬藤本植物葛的肥大塊根，廣泛分布在中國、日本、韓國等地，在我國已有6 000多年的栽培歷史[1-2]。葛根除了是常用的中藥藥材，而且還具有極高的營養(yǎng)保健價(jià)值。葛根素是葛屬植物所特有的黃酮類物質(zhì)[3]，它又稱為葛根黃酮，全名8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7-二羥基異黃酮[4]。研究表明，葛根素能增強(qiáng)心肌的收縮力，保護(hù)心肌細(xì)胞[5-7]，降低血壓[8]，改善眼部血管微循環(huán)[9]，增強(qiáng)機(jī)體的造血功能[10]，對(duì)腎、心臟與肝臟具有一定的保護(hù)作用，還能夠抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換[11]，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力[12-13]，清除氧自由基和抗氧化性損傷[14-16]，降低血漿中兒茶酚胺的含量，調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性，提升體內(nèi)NO水平[17]。

超聲波指的是頻率高于20 000 Hz的聲波，是一種機(jī)械振動(dòng)的傳播過程，具有方向性好，穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18]?，F(xiàn)代社會(huì)中，超聲波被廣泛應(yīng)用于金屬探傷[19]、水下定位、診斷疾病、工業(yè)生產(chǎn)[20]、環(huán)境保護(hù)、生物工程[21]等領(lǐng)域。超聲波提取是一種利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)與空化作用來促使植物的有效成分的浸出方法[22]。超聲波在機(jī)械振動(dòng)的時(shí)候能夠產(chǎn)生傳遞能量，促使植物的有效成分加速進(jìn)入溶劑中。空化作用就是當(dāng)液體中在存在巨大的破壞力的時(shí)候，液體內(nèi)部會(huì)形成空化泡的現(xiàn)象[23]。空化泡在破裂時(shí)將把泡內(nèi)的能量全部釋放，產(chǎn)生瞬時(shí)的高溫和高壓，引起細(xì)胞壁的破壞，從而使得細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)直接浸出并與溶劑充分混合，提高物質(zhì)的提出率[24]。研究表明，從黃芩[25]、槐米、山楂[26]、五加皮以及陳皮[27]等植物中提取黃酮類物質(zhì)，使用超聲波提取之后，提取率都得到了巨大的提高。

將超聲波技術(shù)應(yīng)用于植物各種成分的提取，必有廣闊的應(yīng)用前景。超聲波提取法與諸多傳統(tǒng)的提取工藝相比，不僅顯著提高細(xì)胞物質(zhì)的溶出速度、縮短提取的時(shí)間，而且提出率很高。我國葛根資源豐富，區(qū)域成本不高，具有數(shù)量優(yōu)勢、質(zhì)量優(yōu)勢等經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)勢。目前，我國葛根開發(fā)的主要困難是缺乏先進(jìn)的技術(shù)、產(chǎn)品形式比較單一。如將葛根與酒結(jié)合，不僅能發(fā)揮葛根與酒的各自的優(yōu)點(diǎn)，更有利于中國酒文化在今后的發(fā)展。開發(fā)葛根藥酒對(duì)我國葛根資源利用率不高的現(xiàn)狀具有現(xiàn)實(shí)意義。葛根和藥酒在我國都具有很大的市場潛力，開發(fā)研制葛根酒，輔以超聲波提取技術(shù)，不僅為葛根，也為藥酒的現(xiàn)代化工業(yè)化提供了新的思路，具有十分廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根塊 江蘇省句容市中蘇容生態(tài)農(nóng)副產(chǎn)品發(fā)展有限公司生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園；食用酒精 江蘇省味研食品有限公司；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 浙江凱豐集團(tuán)有限公司；高效液相色譜儀 美國Agilent 技術(shù)公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超聲波清洗儀 江蘇壘君達(dá)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根露酒的提取

采用預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的提取葛根素的最佳條件為根與基酒的固液比為1∶25（g/mL），基酒為體積分?jǐn)?shù)55%的食用酒精，然后進(jìn)行超聲波處理，靜置一段時(shí)間后測定葛根素含量。

1.3.2 葛根素含量的測定

采用高效液相色譜法，色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：水；洗脫條件：流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B = 75∶25（V/V）；檢測波長：249 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 ?L。

以葛根素標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的回歸方程為y=107.1x＋364.6（R2=0.999）。y為葛根素標(biāo)品峰面積；x為葛根素質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

挑選外觀良好的、大小均勻的葛根塊，稱取4 g，加入100 mL的體積分?jǐn)?shù)55%的食用酒精中，超聲功率140 W條件下超聲15 min，室溫浸泡24 h后測定其中葛根素的含量。固定其他條件，分別考察浸泡時(shí)間（4、8、12、16、20、24、48、72、96 h）、超聲功率（100、120、140、160、180、200 W）、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）對(duì)葛根素的含量的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸泡時(shí)間、超聲功率、超聲時(shí)間因素，以葛根素浸出含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1，每組重復(fù)3次。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and their coded levels used in Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 7.0軟件處理，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)葛根素浸出量的影響

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)葛根素浸出量的影響Fig.1 Effect of soaking time on the extraction efficiency of puerarin

由圖1可知，超聲處理之后，在開始的24 h以內(nèi)，葛根素浸出量隨著浸泡時(shí)間的延長而增加，24 h以后，葛根素的浸出量穩(wěn)定，浸泡時(shí)間的延長不會(huì)引起葛根素浸出量的變化，故選擇24 h作為葛根露酒的浸泡時(shí)間。

2.1.2 超聲功率對(duì)葛根素浸出量的影響

圖2 2 超聲功率對(duì)葛根素浸出量的影響Fig.2 Effect of power of ultrasonic power on the extraction efficiency of puerarin

由圖2可知，葛根素浸出量隨著超聲功率的變化而變化，當(dāng)超聲功率低于120 W時(shí)，葛根素未能夠浸提完全，而當(dāng)超聲功率高于120 W時(shí)，葛根素浸出量隨著超聲功率的增加而減少。其原因可能是超聲功率過大引起葛根細(xì)胞里面一些分解葛根素的酶內(nèi)物質(zhì)浸出，從而引起葛根素浸出量的降低，故超聲功率的最后選擇為120 W。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)葛根素浸出量的影響

圖3 超聲時(shí) 間對(duì)葛根素浸出量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction efficiency of puerarin

由圖3可知，葛根素浸出量隨著超聲時(shí)間的變化而變化，當(dāng)超聲時(shí)間低于15 min時(shí)，葛根素浸出量隨著超聲時(shí)間的延長而增加，而當(dāng)超聲功率高于15 min時(shí)，葛根素浸出量隨著超聲時(shí)間的延長而降低。結(jié)果分析原因可能是超聲時(shí)間過長，導(dǎo)致葛根細(xì)胞里面一些分解葛根素的酶內(nèi)物質(zhì)浸出，從而引起葛根素浸出量的降低，故超聲時(shí)間的最終選擇15 min。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化葛根露酒的超聲提取工藝

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)一共選擇試驗(yàn)點(diǎn)17個(gè)，其中12個(gè)析因點(diǎn)、5個(gè)零點(diǎn)，方案與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析

用Design Expert 7.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出3個(gè)影響因素與葛根素浸出量之間的二次回歸方程：Y=87.94-1.44A＋0.15B-7.16C-0.43AB-0.2AC-1.33BC-1.42A2-4.85B2-5.27C2。

從表3可以看出，模型的P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01，這說明該模型極顯著，與試驗(yàn)擬合較好。本試驗(yàn)中的決定系數(shù)R2=0.964 9，說明葛根素浸出量的結(jié)果與模型回歸值有著良好的一致性。模型校正系數(shù)R2Adj=0.919 8，說明試驗(yàn)結(jié)果有91.98%受到所選因素的影響。失擬項(xiàng)F=0.142 7＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該方程能夠充分反映實(shí)際情況。因此，此模型可以用來 預(yù)測超聲條件對(duì)葛根素浸出含量的影響?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)葛根素浸出量的影響次序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞浸泡時(shí)間＞超聲功率。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖如圖4所示。從圖4a可以看出，隨著超聲功率的加強(qiáng)和浸泡時(shí)間的延長，葛根素浸出量先增高后降低；從等高線圖可以清楚的看出，浸泡時(shí)間所對(duì)應(yīng)的等高線更陡，說明相對(duì)于超聲功率來說，浸泡時(shí)間的影響更顯著。圖4b、c表明隨著超聲時(shí)間、浸泡時(shí)間和超聲功率的延長，葛根素浸出量先增高后降低；超聲時(shí)間對(duì)葛根素浸出量的影響大于浸泡時(shí)間（圖4b），而超聲時(shí)間對(duì)葛根素浸出量的影響大于超聲功率（圖4c）。

圖4 兩因素交互影響響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of three process parameters on the extraction efficiency of puerarin

2.2.4 超聲工藝的優(yōu)化組合及其驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果和二次多項(xiàng)式方程，利用De sign-Expert軟件計(jì)算出最佳超聲工藝條件，葛根露酒的最佳超聲工藝條件為：浸泡時(shí)間22.1 h、超聲功率122.60 W、超聲時(shí)間11.56 min。為了便于操作，將以上條件參數(shù)做微小的修正：浸泡時(shí)間22 h、超聲功率120 W、超聲時(shí)間12 min。根據(jù)改修正的工藝條件，經(jīng)過5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，葛根露酒的葛根素浸出量可以達(dá)到89.6 mg/g，與理論值相比，降低了1.28%，可見該模型較好的預(yù)測了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)分析了葛根露酒生產(chǎn)過程中最佳的超聲波條件。采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析，建立了超聲工藝的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明是有效的，能夠有效的預(yù)測葛根素浸出量。最后確定最佳的超聲工藝條件：浸泡時(shí)間22 h、超聲功率120 W、超聲時(shí)間12 min，在此條件下，葛根露酒的葛根素浸出量可以達(dá)到89.6 mg/g。

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Optimization of Ultrasound Extraction Process of Puerarin by Response Surface Methodology

QIU Yuan, RUI Xin, XIE Yi-dong, LI Wei, CHENG Xiao-hong, JIANG Mei, DONG Ming-sheng* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Kudzu root wine, made by soaking kudzu root in 55% food-grade alcohol was treated by ultrasound before being allowed to stand for a certain time to accelerate the extraction of puerarin. Three process parameters including ultrasound power, treatment time and subsequent soaking time were optimized by response surface methodology to be 120 W, 12 min and 22 h, respectively. Under these conditions, the amount of puerarin extracted from kudzu root was 89.6 mg/g.

kudzu root; puerarin; kudzu root wine; ultrasonic; response surface methodology

TS252.54

A

1002-6630（2014）06-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201406001

2013-07-11

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371807）；國家自然科 學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201422）；

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100903；2013BAD18B01-4）；國家農(nóng)業(yè)科技成 果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012GB23600639）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2011651）；教育部博士點(diǎn)基金新教師類課題（20110097120028）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

邱遠(yuǎn)（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)橹袊鴤鹘y(tǒng)食品與功能性物質(zhì)。E-mail：quincy0213@gmail.com

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn