林 海，蔡 穎，但國(guó)蓉，董兆君

（1．第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院醫(yī)教部，重慶400037；2．第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院，重慶400038）

氫氰酸（hydrogen cyanide，HCN）、氰化鈉（sodi －um cyanide，NaCN）、氰 化 鉀 （potassium cyanide，KCN）是劇毒的化學(xué)物質(zhì)，因其分子中都含有氰基（CN），故又稱作氰類化合物。此類化合物是非常重要的工業(yè)原料，在冶金、制藥、塑料、化纖、制革等行業(yè)有廣泛的用途。因化學(xué)泄露而導(dǎo)致的人員傷亡事故時(shí)有發(fā)生。HCN和氯化氫（cyanogen chloride）又是外軍裝備速殺型化學(xué)戰(zhàn)劑，其毒性大、作用快，能在短時(shí)間內(nèi)造成大批人員中毒死亡，被視為大規(guī)模殺傷性武器［1－3］。因此，對(duì)氰中毒的防治研究一直是軍事醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)方向。迄今效果較佳的抗氰藥物是高鐵血紅蛋白（methemoglobin，MHb）形成劑，主要的有亞硝酸鈉（亞硝酸鈉）、亞硝酸異戊酯（amyl nitrite）、4－二 甲 基 氨 基 苯 酚 （4－diaminophenol，4－DMAP）和對(duì)氨基苯丙酮（P－Aminopropiophene）作用快，抗氰能力都強(qiáng)，但需要消耗大量的血紅蛋白，容易造成缺氧而加重病情的發(fā)展，甚至有造成MeHb血癥的危險(xiǎn)，尤其不適用于火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)氰中毒救治［4～9］。因此，尋找新型抗氰藥物是當(dāng)前該領(lǐng)域的重大任務(wù)。本單位自本世紀(jì)初發(fā)展了新一代抗氰藥物DDD，它能利用全新的概念清除體內(nèi)的游離氰離子。前期試驗(yàn)業(yè)已證實(shí)效果良好，尤其在中毒前用藥時(shí)能發(fā)揮極好地預(yù)防效果。但該化合物是否也能形成MHb，是該化合物能否發(fā)展成為新型抗氰藥物的前提。為此，我們以wistar大白鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以4－DMAP為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，比較二者在常氧和缺氧條件下形成MeHb的能力，其結(jié)果對(duì)于闡明該藥的藥理學(xué)特征，保證其臨床安全應(yīng)用具有重要意義。

1 材料和方法

1．1 試劑和儀器 鐵氰化鉀 K3［Fe（CN）6］購(gòu)自美國(guó)Fluka公司，臨用前新鮮配制。DDD為第三軍醫(yī)大學(xué)防化教研室合成，4－DMAP由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供，純度大于95%，新鮮配制。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。752型分光光度計(jì)為上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1．2 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組 wistar大白鼠雌雄各半，體質(zhì)量241±5g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飲料喂養(yǎng)。選取大鼠40只隨機(jī)分為AB兩大組，各下設(shè)對(duì)照、10min、30min和60min四個(gè)亞組。對(duì)A組大鼠，按照5ml／kg容積通過(guò)灌胃針給予DDD（100mg／kg）。0min組大鼠則以同法給予蒸餾水；對(duì)于B組大鼠，按照5ml／kg容積通過(guò)腹腔注射4－DMAP（3mg／kg）。0min組大鼠則以同法給予蒸餾水。于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取全血，測(cè)定MeHb含量。再取大鼠30只，隨機(jī)分成C、D、E、F、G、H等組，每組5只。C、D、E組分別以灌胃法給予 DDD 50、100、150mg／kg；F、G、H 組則分別以腹腔注射法給予4－DMAP 1．0、2．0和3．0mg／kg。同樣于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取全血，測(cè)定MeHb含量。

1．3 Hb和 MHb測(cè)定 Hb測(cè)定按照文獻(xiàn)［7］報(bào)道方法進(jìn)行，稍加改進(jìn)。試管中加入血紅蛋白測(cè)試液（0．05g氫氧化鈉，0．20g高鐵氰人鉀0．14g磷酸氫二鉀，1ml Triton X－100，加蒸餾水至1000ml）5ml，吸取20ul紅細(xì)胞懸液，擦去吸管外血液后，輕輕加于試管底部，混勻后作用5min，540nm比色得吸光度。計(jì)算血紅蛋白 Hb總量（g／L）＝A×251×64458／44000＝A×36717。

高鐵血紅蛋白測(cè)定，血樣稀釋：取1離心管加入5ml的1／60磷酸鹽溶液和血樣50ul即成。取兩只容量為1．5ml的EP反應(yīng)管，分別標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管。各加入1ml稀釋血樣，以1／60磷酸鹽溶液調(diào)零。測(cè)定管比色OD630nm值記為A1，加入中性氰化鈉溶液1滴混勻，2min后比色得OD630nm值記為A2．標(biāo)準(zhǔn)管先加入10%鐵氰化鉀溶液1滴混勻，2min后測(cè)OD630nm值，記為A3。再加入中性氰化鈉溶液1滴，混勻，2min后比色測(cè)OD630nm值，記為A4。所得結(jié)果按照下式計(jì)算：MHb%＝（A1－A2）／（A3－A4）×100%，MeHb含量（g／100ml）＝Hb含量×MHb%。

2 結(jié)果

灌胃DDD大鼠在觀察時(shí)間內(nèi)無(wú)任何異常表現(xiàn)。腹腔注射4－DMAP的大鼠除在5～30min內(nèi)活動(dòng)減少外，也未出現(xiàn)其他異常表現(xiàn)。

2．1 時(shí)間－效應(yīng)結(jié)果 如表1所示，大鼠以DDD處理后60min內(nèi)，血液MeHb含量略有波動(dòng)，但未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)意義的變化。而腹腔注射4－DMAP的大鼠，10min血液 MeHb顯著升高，30min達(dá)到最高值。60min時(shí)血液MeHb含量有所下降，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照水平。10、30、60min分別為對(duì)照的 3．58、9．32、8．02倍。

表1 DDD和4－DMAP對(duì)大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表1 DDD和4－DMAP對(duì)大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

注：與對(duì)照組比較①P＜0．05

組別 對(duì)照 給藥后時(shí)間（min）10 30 60 2．87±0．32 2．42±0．19 2．56±0．41 A 2．24±0．25 B 2．41±0．32 8．62±0．93①①19．33±4．12①

2．2 劑量－效應(yīng)結(jié)果 表2所列為給藥30min后，DDD和4－DMAP對(duì)大鼠血液MeHb濃度的影響。由表中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，DDD在所選劑量范圍內(nèi)不明顯改變血液MeHb濃度。4－DMAP與DDD不同，血液 MeHb濃度隨著用藥劑量的增加而升高。若以表1的對(duì)照組結(jié)果（2．41）為基點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)劑量為1．0、2．0、3．0mg／kg時(shí) 的 MeHb 濃 度 分 別 升 高 6．63、8．32、11．89倍。

表2 不同劑量DDD和4－DMAP對(duì)大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表2 不同劑量DDD和4－DMAP對(duì)大鼠血液MeHb含量的影響［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

藥物 劑量分組A B C A 2．35±0．44 2．42±0．19 2．71±0．42 D E F B 18．54±2．93 22．47±3．67 31．08±4．04

3 討論

分子中含有氰基的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱為氰類化合物，包括前述的氰化氫（HCN）、氰化鈉（NaCN）、氰化鉀（KCN）和氯化氰（CNC1）等。HCN、NaCN、KCN 是用途非常廣泛的化工原料，可以作為原材料，也可以作為中間體。其生產(chǎn)、儲(chǔ)存量及市場(chǎng)需求非常巨大。因保管、運(yùn)輸使用不當(dāng)所造成的泄露事故屢見(jiàn)不鮮。HCN和CNC1則是外軍裝備的化學(xué)戰(zhàn)劑。雖然有國(guó)際禁止化學(xué)武器公約的限制，世界各國(guó)均承諾不生產(chǎn)、儲(chǔ)存和使用化學(xué)武器，但由于氰類毒劑制造方法非常簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，隱蔽性很大且殺傷力極強(qiáng)，在未來(lái)戰(zhàn)爭(zhēng)中使用的可能性仍然很大。因此，對(duì)化學(xué)戰(zhàn)劑，特別是對(duì)氰類戰(zhàn)劑的防護(hù)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外軍事醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。

真核細(xì)胞線粒體的細(xì)胞呼吸鏈?zhǔn)怯梢幌盗械倪f氫體和電子傳遞體（eletron transfer）組成的一個(gè)連續(xù)反應(yīng)體系。其主要職責(zé)是負(fù)責(zé)將底物脫下的氫原子交給氧生成水，同時(shí)生成三磷酸腺苷（ATP）。其主要的限速酶是位于呼吸鏈最后的細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）。COX 的催化過(guò)程如同戲劇般地復(fù)雜和奇妙，歷經(jīng)多次電子轉(zhuǎn)移之后，最終使一個(gè)氧氣分子還原為兩個(gè)水分子。期間凈利用了還原的細(xì)胞色素c提供的4個(gè)電子（e）。消耗了8個(gè)質(zhì)子，但又產(chǎn)生了4個(gè)質(zhì)子。而這些電子的傳遞過(guò)程離不開(kāi)血紅素A。

COX的血紅素A是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)亞鐵離子配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位的一個(gè)組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子（Fe2＋）配位結(jié)合。Fe2＋能結(jié)合分子氧，而對(duì)CN的其親和力。外源性氰化物進(jìn)入體內(nèi)后很快解離除CN－，后者通過(guò)彌散作用進(jìn)入線粒體并迅速與COX的Fe2＋或者Fe3＋結(jié)合，使之喪失傳遞e的能力。這就是氰化物中毒的本質(zhì)［8］。

迄今為止，國(guó)外自上世紀(jì)50年代開(kāi)始研究，70年代到高峰：我國(guó)自上世紀(jì)80年代開(kāi)始研究，90年代達(dá)到高峰。迄今已研發(fā)了四代抗氰藥物：①第一代以美蘭和硫代硫酸鈉為代表。美蘭臨床科用于治療尿路結(jié)石、治療閉塞性脈管炎等。也用于治療氰化物中毒，但用量大，需要靜脈注射，且有惡心、腹痛、心前區(qū)痛、眩暈、頭痛、出汗和神志不清等不良反應(yīng)。后者能結(jié)合氰離子，臨床效果也不錯(cuò)。但該藥也只能靜脈注射，用量同樣很大。②第二代是亞硝酸鹽類化合物，主要有亞硝酸鈉和亞硝酸異戊枉費(fèi)。前者只能靜脈滴注，后者只能經(jīng)呼吸道吸入使用。二者有共同的作用原理，即可以措施體內(nèi)的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為MeHb。MeHb即可競(jìng)爭(zhēng)氰離子，從而發(fā)揮抗氰作用。但他們都有很明顯的心血管副作用，可能導(dǎo)致血管擴(kuò)張和血壓劇變。加之其結(jié)合氰離子并不牢固，其效果不穩(wěn)定，容易臨床癥狀的反復(fù)，逐漸引起眾的厭棄。③第三代是氨基酚類化合物，以4－DMAP和PAPP為代表。它們與亞硝酸鹽類比較有明顯的優(yōu)勢(shì)：可以肌肉注射，也可以口服，適用比較方便；吸收極為迅速，即使在發(fā)生休克時(shí)然可以在5min內(nèi)達(dá)到需要的血藥濃度；在體內(nèi)的半衰期比較長(zhǎng)，維持藥效時(shí)間比較久。救治氰中毒時(shí)，4－DMAP只需注射一次；預(yù)防氰中毒時(shí)，PAPP可以預(yù)防12h［9］。④第四代即目前各國(guó)正在研究開(kāi)發(fā)的新型的或新作用原理的抗氰藥物。DDD即為其中之一，其設(shè)計(jì)思路是為機(jī)體提供一種能結(jié)合氰離子的前體物質(zhì)，待其進(jìn)入體內(nèi)后可自動(dòng)轉(zhuǎn)化為能結(jié)合氰離子的物質(zhì)?？梢?jiàn)，氨基酚類抗氰藥物雖然抗氰效果好，但由于其能消耗大量血紅蛋白，有不適合于缺氧環(huán)境的致命弱點(diǎn)，也有形成極高M(jìn)eHb血癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，新設(shè)計(jì)的DDD必須具備不形成MeHb的特性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常大鼠血液存在一定濃度的MeHb，其含量不越過(guò)3%。給予4－DMAP后血液MeHb含量迅速升高，30min達(dá)到高峰，60min雖然有所下降，但仍遠(yuǎn)高于對(duì)照水平。這與早期結(jié)果基本吻合，也是4－DMAP 具有良好抗氰效果的基礎(chǔ)［7，10～14］。但從表1數(shù)據(jù)可以看出，口服DDD后60min內(nèi)大鼠血液MeHb濃度基本不受影響。這說(shuō)明DDD不具備形成MeHb的能力。從理論上分析，4－DMAP是一個(gè)含有苯基的化合物，具有很強(qiáng)氧化還原活性，所以能夠促使血紅蛋白之血紅素A的鐵離子（Fe2＋）轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3＋。但DDD不具備氧化還原活性的結(jié)構(gòu)，它只能提供一個(gè)巰基。所以沒(méi)有使血紅蛋白轉(zhuǎn)化為MeHb的可能。在50、100、150mg／kg三中劑量時(shí)，它都沒(méi)引起大鼠血液MeHb濃度的明顯變化。因此，可以基本上判斷該藥于MeHb形成沒(méi)有因果關(guān)系。但是，能夠促使血液氰離子排泄而具有抗氰作用的藥物還很多，如硫代硫酸鈉、羥鈷胺素等。DDD的藥效評(píng)估尚需其他的試驗(yàn)結(jié)果予以證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，4－DMAP是 MeHb形成劑，DDD不具備形成MeHb的能力。

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