杜 璠，劉志斌，賀永進

（延安大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨二科，陜西 延安716000）

骨肉瘤（Osteosareoma，OS）是最常見的惡性、原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于兒童、青少年，其惡性程度高，發(fā)展迅速，15%的患者在明確診斷時已發(fā)生肺部腫瘤轉(zhuǎn)移［1］。因此，研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找有效的早期診斷指標及治療靶點，對骨肉瘤的早期診斷與治療具有重大意義。

Piwi相互作用 RNA（Piwi－interactingRNA，piRNA）是目前研究發(fā)現(xiàn)的與Piwi蛋白相作用的一類新的非編碼小RNA，長約24～33個核苷酸，大量研究報道，piRNA在多個層面上調(diào)控基因的表達，參與疾病的發(fā)生，piRNA所調(diào)控的基因的異常表達會產(chǎn)生嚴重的病理變化，甚至可以導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2～4］。piRNA－651在胃癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌中異常高表達，且干擾胃癌細胞中piRNA－651的異常表達可以明顯抑制胃癌細胞的增殖［5］。但piRNA－651對骨肉瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有何影響，目前尚少見報道。因此，該研究探討piRNA－651對骨肉瘤細胞株U20S細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能分子機制，以期進一步研究piRNA－651對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的作用，為骨肉瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料 TRIzol及LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自TaKaRa公司，干擾RNA由上海吉瑪公司合成，MTT試劑盒購自Promega公司；Transwell小室購自Milipore公司；U20S細胞由本校實驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 piRNA－651干擾 RNA 的設(shè)計及合成 piRNA－651的有效干擾序列及對照序列分別命名為piRNA－651－siRNA、piRNA－651－NC（表1）。干擾及對照序列均由上海吉瑪公司合成。

表1 piRNA－651干擾序列及對照序列Table 1 The sequence of small interference RNA of piRNA－651and control RNA

1．2．2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 U20S骨肉瘤細胞用含100 ml／L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、50 ml／L CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合度達到約70%融合后，將siRNA經(jīng)LipofectamineTM2000介導轉(zhuǎn)入細胞中，具體操作見脂質(zhì)體試劑說明。轉(zhuǎn)染后細胞分別命名為piRNA－651－siRNA 組、PIRNA－651－NC組。

1．2．3 piRNA－651表達水平檢測 收集細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。PIRNA－651，內(nèi)參照U6引物序列（表2）。qRT－PCR反應(yīng)條件為：95℃3min，95℃10s，55℃30s，共40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。

表2 piRNA－651內(nèi)參照U6引物序列Table 2 The sequence of piRNA－651internal reference U6

1．2．4 MTT法檢測U20S的增殖 取對數(shù)生長期的U20S細胞，制備單細胞懸液，以5×103／孔細胞密度接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，待細胞密度達到50%左右，轉(zhuǎn)染siRNA，6小時后，換液，分別培養(yǎng)1～5d，每孔加入20μl 1．5g／L MTT，培養(yǎng)4小時后每孔加入150μl DMSO，讀取吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1．2．5 流式細胞儀檢測各處理細胞周期情況 分別取轉(zhuǎn)染48小時的細胞及對照細胞，制備細胞懸液，用2ml PBS，1500r／min離心5min，反復(fù)洗滌2次后，用預(yù)冷70%乙醇在－20℃固定24小時，PBS洗兩遍，棄上清；細胞沉淀中加入0．1%RNA酶A溶液150μl，重懸細胞，4℃孵育30min；加入0．1%PI染色液120μl混勻，4℃避光孵育10min；將細胞懸液混勻，用200目尼龍膜過濾細胞到流式細胞管中，以除去細胞團塊；上FACScan流式細胞儀檢測。

1．2．6 Transwell侵襲實驗檢測U20S細胞侵襲能力U20S細胞轉(zhuǎn)染24小時后，制備單細胞懸液，PBS洗1～2遍，無血清培養(yǎng)基重懸細胞（細胞密度為8×103／mL），取每組細胞懸液200μl加入用Matrigel包被基底膜的Transwell小室的上室中，下室中加入含100ml／L胎牛血清的培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。取出小室，PBS沖洗3遍，乙醇固定，結(jié)晶紫染色，小室基底膜風干鏡檢，隨機選取6個視野計數(shù)取平均值并照相。

1．2．7 細胞劃痕試驗檢測U20S細胞遷移能力 用0．25%胰酶消化分別轉(zhuǎn)染 piRNA－651－siRNA、PIRNA－651－NC 24小時及空白對照細胞，制備細胞懸液，以每孔1．5×106個細胞的密度接種到6孔板中，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使其在劃痕時6孔板中的細胞完全鋪滿；用Tip頭沿著直尺垂直孔后的橫線劃痕，盡量避免傾斜，劃痕后用無菌PBS沖洗2次，洗去劃下的細胞碎片。于37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，在倒置顯微鏡下以10倍的視野在相同的條件下觀察，在相同的細胞劃痕的視野下拍照；利用ImagePro軟件分析細胞遷移的距離。

1．3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12．0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多個組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 piRNA－651－siRNA 下調(diào) U20S細胞中piRNA－651的表達 轉(zhuǎn)染PIRNA－651－siRNA及對照序列于U20S細胞系，48小時后，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光實時定量qRT－PCR檢測mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)與PIRNA－651－NC組、空白對照組相比，piRNA－651－siRNA 組 piRNA－651 表 達 明 顯 下 調(diào) （P＜0．05，圖1）。

圖1 qRT－PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNAU20S細胞中piRNA－651表達水平Fig．1 The expression level of piRNA－651after transfected siRNA into U20Scells by qRT－PCR．

2．2 piRNA－651－siRNA 抑制 U20S細胞的增殖MTT 檢測piRNA－651－siRNA 組、piRNA－651－NC組與空白組細胞增殖情況。結(jié)果顯示，從檢測后第2天開始，piRNA－651－siRNA 組細胞的增殖較piRNA－651－NC組和空白對照組細胞出現(xiàn)明顯的生長抑制（圖2）。

圖2 MTT法檢測各組轉(zhuǎn)染siRNA對U20S細胞增殖的影響Fig．2 The proliferation ability of different groups of cells by MTT

2．3 piRNA－651－siRNA 對 U20S細胞周期的影響流式細胞術(shù)檢測piRNA－651－siRNA 組、piRNA－651－NC組與空白組各組細胞的細胞周期分布情況，結(jié)果可見piRNA－651－siRNA與piRNA－651－NC組和空白組間相比，細胞周期明顯阻滯在G2／M期（表3）。

表3 細胞周期檢測結(jié)果（±s）Table 3 The result of cell cycle

表3 細胞周期檢測結(jié)果（±s）Table 3 The result of cell cycle

實驗組 G0／G1 S G2／M空白組40．15±1．89 42．19±3．62 17．66±2．13 piRNA－651－NC 42．23±2．16 39．14±1．65 18．63±3．87 piRNA－651－siRNA 44．69±2．71 24．07±3．11 31．24±2．19

2．4 干擾piRNA－651對U20S細胞的侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗檢測piRNA－651－siRNA 對U20S細胞的侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染piRNA－651－siRNA的細胞，穿過微孔膜的細胞數(shù)目明顯少于piRNA－651－NC組和及空白組。經(jīng)細胞計數(shù)與統(tǒng)計分析，干涉組與對照組間細胞的穿過微孔的數(shù)目存在顯著差異（P＜0．05），而piRNA－651－NC組與空白組間無明顯差異（圖3）。

圖3 Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后細胞的侵襲能力Fig．4 The invasive ability of cells after transfected siRNA by Transwell

2．5 干擾piRNA－651對U20S細胞的轉(zhuǎn)移能力的影響 細胞劃痕實驗檢測piRNA－651－siRNA對U20S細胞的轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染piRNA－651－siRNA組，細胞的遷移能力比對照組顯著減弱，統(tǒng)計分析劃痕區(qū)面積變化，差異有統(tǒng)計學意義，說明piRNA－651－siRNA能夠降低U20S的遷移能力（圖4）。

圖4 劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后細胞的轉(zhuǎn)移能力Fig．5 The migrated ability of cells after transfected siRNA by wound healing test

3 討論

對非編碼RNA的研究已經(jīng)成為當前全球生物研究關(guān)注的熱點。2006年，在果蠅、小鼠、大鼠和人類的生殖細胞研究中同時發(fā)現(xiàn)了一類新型的特異地與piwi蛋白質(zhì)相互作用的小分子非編碼RNA，命名為piwi相互作用的RNA。piRNA長約26～31nt，其中與Argonaute蛋白相聯(lián)系的piRNAs，可以調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)合成、染色質(zhì)組織結(jié)構(gòu)等過程，并參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前有研究報道顯示，piRNAs所調(diào)控的基因的異常表達會導致嚴重的病理變化，甚至可以導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Jia Cheng等運用RTPCR、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)等技術(shù)探討piRNAs與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤之間的關(guān)系，并相繼證明了piRNA－651及piRNA－853等多種piRNAs在胃癌中的作用，具 有 重 要 的 臨 床 意 義［5，6］，Law PT 等 發(fā) 現(xiàn)piR－Hep1在肝癌中高表達，初步證實piR－Hep1在肝癌中的作用及作為肝癌預(yù)后的標志物的潛能［7］。此外，有研究報道，piR－4987、piR－20365、piR－20485及piR－20582在乳腺癌組織中表達上調(diào)［8］。

有研究證明沉默piRNA－651在胃癌細胞中的表達可明顯的抑制胃癌細胞的增殖［5］。本課題研究發(fā)現(xiàn)piRNA－651在骨肉瘤的發(fā)生、進展中發(fā)揮著重要的作用。干擾piRNA－651的表達可以將U20S細胞周期阻滯在G2／M期，從而抑制骨肉瘤細胞U20S的增殖，提示piRNA－651的異常高表達可以促進骨肉瘤的生長；在臨床中，骨肉瘤極易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，超過90%的骨肉瘤患者的死亡都歸因于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，探索骨肉瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要的研究價值。本研究通過檢測沉默piRNA－651對U20S細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)現(xiàn)沉默piRNA－651的表達，骨肉瘤細胞U20S的侵襲與轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制，提示piRNA－651與骨肉瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，piRNA－651可能成為骨肉瘤預(yù)后判定的分子標志物。

4 結(jié)論

本研究利用RNA干擾技術(shù)沉默骨肉瘤細胞U20SpiRNA－651的表達，通過多種實驗方法觀察到piRNA－651沉默可以抑制骨肉瘤細胞生長、遷移與侵襲，說明piRNA－651在骨肉瘤形成、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。為進一步研究piRNA－651在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的分子作用機制提供了理論基礎(chǔ)，為臨床骨肉瘤的預(yù)后判定、靶向治療提供了新的思路。

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