侯茂霞，戴玉杰，符宏磊，岳利芳，滿淑麗

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

人工懸浮培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖對小鼠免疫功能的影響

侯茂霞，戴玉杰，符宏磊，岳利芳，滿淑麗

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

研究人工懸浮培養(yǎng)的發(fā)菜胞外多糖對小鼠非特異性及特異性免疫能力的影響．體內實驗表明：50～100mg/(kg·d)的發(fā)菜胞外多糖能夠顯著提高小鼠單核巨噬細胞吞噬碳粒的能力和NK細胞的自然殺傷活性(P＜0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，同時，發(fā)菜胞外多糖能在一定程度上提高腹腔巨噬細胞的吞噬能力，起到提高機體非特異性免疫水平的作用．與空白組相比，高、低劑量的發(fā)菜胞外多糖對小鼠臟器指數(shù)、二硝基氟苯誘導的遲發(fā)型超敏反應(DTH)、脾淋巴細胞的增殖均無顯著性影響，表明人工培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖對小鼠特異性免疫系統(tǒng)無顯著性效果．

發(fā)菜；胞外多糖；NK細胞；DTH；非特異性免疫；脾淋巴細胞

發(fā)菜(又稱發(fā)狀念珠藻)為生長于干旱半干旱地區(qū)的珍稀陸生藍藻，在我國主要產于西北部的寧夏、甘肅和內蒙古等地區(qū)，它能分泌一種黏性物質于胞外形成膠質鞘將細胞包裹起來，膠質鞘主要成分為胞外多糖，起到保水和防紫外線等作用．研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖具有抗單純性皰疹病毒、人巨細胞病毒和甲型流感病毒等包膜病毒的活性[1–2]，同時發(fā)菜胞外多糖能清除多種自由基，其中對羥自由基具有很強的清除作用[3–4]．但由于野生發(fā)菜為國家一級保護植物，使發(fā)菜及其多糖應用受到限制．

近年來研究發(fā)現(xiàn)，可通過人工液體懸浮培養(yǎng)方法培養(yǎng)發(fā)菜細胞，人工培養(yǎng)的發(fā)菜細胞會將胞外多糖分泌到培養(yǎng)液中[1]，因此，發(fā)菜細胞人工液體培養(yǎng)過程中可從培養(yǎng)液獲得胞外多糖．Jia等[5]研究發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖具有與野生發(fā)菜多糖相近的結構和組成，人工培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖的相對分子質量可達2.7×105，其單糖組成主要為葡萄糖(43.2%)、木糖(20.6%)、半乳糖(29.9%)、甘露糖(6.3%)．Han等[6]證實人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖具有較好的乳化性、絮凝性和較高的黏度，并且具有更復雜的單糖組成．對于人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖與野生發(fā)菜多糖生物活性的比較也有一些報道[7]．但發(fā)菜多糖免疫調節(jié)活性的研究及報道不多．本文通過研究發(fā)菜胞外多糖對小鼠巨噬細胞、NK細胞和脾淋巴細胞增殖以及遲發(fā)型超敏反應(DHT)的影響，探討人工培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖對小鼠非特異性免疫和特異性免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用．

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

印度墨汁，天津市軒昂科工貿有限公司試劑分公司；二硝基氟苯(DNFB)、刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)，北京索來寶公司；CCK-8，日本同仁化學研究所；其他試劑均為分析純．

1.2 實驗動物及分組情況

BALB/c小鼠，SPF級，雄性，體質量為18～20g，購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK(京)2009-0017．將小鼠隨機分為3組，每組12只，分別為空白組、發(fā)菜多糖50mg/(kg·d)劑量組即低劑量組、發(fā)菜多糖100mg/(kg·d)劑量組即高劑量組，飼養(yǎng)于天津科技大學食品學院動物房(溫度20～25℃、相對濕度(50±5)%)．

1.3 發(fā)菜胞外多糖的制備

發(fā)菜細胞人工培養(yǎng)20d后，培養(yǎng)液使用截流相對分子質量為10,000,的超濾膜濃縮．濃縮液在4,000r/min離心10min后得上清液．向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)為80%，4℃過夜，使用sevag法[8]反復除蛋白7次后，將多糖冷凍干燥，最后得到發(fā)菜胞外多糖(使用苯酚–硫酸法測得其多糖含量為73%)．

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的測定

小鼠灌胃14d后，以0.01mL/g(相對于體質量)的劑量尾靜脈注射稀釋后的印度墨汁(V(生理鹽水)∶V(印度墨汁)＝4∶1)，分別在2min和10min時于內眥靜脈叢取血20μL，立即將其加入到2mL質量分數(shù)為0.1%的Na2CO3溶液中并將其混勻，于600nm下測定其吸光度[9]．最后將小鼠斷頸處死，取肝臟、胸腺和脾臟用0℃生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱質量，根據式(1)計算小鼠臟器指數(shù)．

單核巨噬細胞的吞噬指數(shù)K及廓清指數(shù)α(校正吞噬指數(shù))分別按式(2)和式(3)進行計算.

式中：A1、A2分別為在時間t1、t2時刻所取血樣對應的吸光度；Δt為兩次取血樣的時間差；m1為體質量，g；m2、m3分別為肝質量和脾質量，g．

1.4.2 腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的測定

實驗前，連續(xù)3d向每只小鼠腹腔內無菌注射5%可溶性淀粉1mL．第4天斷頸處死，每只注入5mL 37℃預溫的PBS，輕揉小鼠腹部5min后收集腹腔液．用RPMI1640不完全培養(yǎng)基洗滌從腹腔液中獲得的細胞2次(1,000r/min離心10min)[10]．用RPMI1640完全培養(yǎng)基調整細胞濃度至6×106mL-1，于96孔板內接入巨噬細胞懸液每孔100μL，置于體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)3h．顯微鏡觀察細胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，用37℃預溫的PBS洗滌2次除去未貼壁細胞．每孔加入0.73mg/mL中性紅培養(yǎng)基溶液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)1h．棄去培養(yǎng)液，用37℃預溫的PBS洗滌3～4次，將過量的中性紅洗干凈．加細胞裂解液(V(乙醇)∶V(冰乙酸)＝1∶1)每孔100μL，混勻后4℃過夜，使用酶標儀測定540nm處的吸光度，腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)為實驗組與空白組在540nm處吸光度的比值．

1.4.3 NK細胞自然殺傷活性的測定

末次給藥24h后，將小鼠斷頸處死，按照Ye等的方法[11]并稍加改進后制備脾細胞懸液．方法如下：無菌取脾，用注射器的活塞將脾臟制成單個細胞過100目篩網，再加入紅細胞裂解液Tris-NH4Cl (0.15mol/L NH4Cl，pH為7.4)裂解紅細胞5～10min，待紅細胞完全裂解后，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細胞(1,500r/min離心5min)，棄去上清液．將離心后得到的細胞用RPMI 1,640不完全培養(yǎng)液洗2～3次(1,500r/min離心5min)．用完全培養(yǎng)基將細胞調至適當?shù)臐舛龋?/p>

實驗前24h將靶細胞YAC-1進行傳代培養(yǎng)，應用前以Hank’s液洗3次，用完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為1.5×106mL-1，脾細胞的濃度為7.5×107mL-1，使效靶比為50∶1．反應孔分別加入靶細胞和效應細胞懸浮液各100μL，自然釋放孔分別加入靶細胞懸浮液和培養(yǎng)液各100μL，最大釋放孔分別加入靶細胞懸浮液和1% NP-40各100μL，每組設3個復孔，培養(yǎng)4h后離心(1,500r/min離心5min)，取上清液100μL，同時加入LDH基質液100μL，反應3min后每孔加入1mol/L的HCl溶液30μL，用酶標儀于490nm測定吸光度[12]．NK細胞殺傷百分比按式(4)進行計算．

1.4.4 脾細胞增殖的測定

脾細胞懸浮液的制備參照1.4.3，調整每只老鼠的脾細胞懸液，使細胞濃度為5×106mL-1，每個孔加入180μL脾細胞懸液和20μL的刺激物(50μg/mL的ConA溶液或100μg/mL的LPS溶液)，每個實驗設3個復孔，培養(yǎng)72h后加入CCK-8試劑20μL，顯色4h后，用酶標儀在490nm下測定其吸光度[13]．刺激指數(shù)為實驗組與空白組在490nm處吸光度的比值．

1.4.5 DNFB誘導小鼠遲發(fā)型超敏反應的測定

小鼠灌胃第9天，用硫化鋇脫去腹部的毛(范圍約為3cm×3cm)，再用50μL10g/L DNFB溶液(溶劑為丙酮麻油)均勻涂抹致敏．5d后，用DNFB溶液10μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊．攻擊24h后斷頸處死，剪下左右耳殼．用打孔器取下直徑7mm的耳片，稱量后計算左右耳質量差[14]，以此表示小鼠耳腫脹程度．

1.5 數(shù)據處理

數(shù)據以“平均值±標準差”的形式表示，采用SPSS 19軟件對數(shù)據進行顯著性分析．

2 結果與討論

2.1 發(fā)菜胞外多糖對小鼠體質量及臟器指數(shù)的影響

發(fā)菜胞外多糖對小鼠體質量及臟器指數(shù)的影響見表1．小鼠灌胃發(fā)菜胞外多糖期間體質量穩(wěn)定增長，說明發(fā)菜胞外多糖對小鼠無毒副作用．灌胃兩周后實驗組的臟器指數(shù)較空白組均有一定的變化，其中脾指數(shù)和肝臟指數(shù)均有一定程度的增加，高劑量組的發(fā)菜胞外多糖能使小鼠胸腺指數(shù)有所增加，但較空白組均無顯著性差異．說明發(fā)菜胞外多糖對小鼠組織器官沒有毒害作用．

表1 發(fā)菜胞外多糖對小鼠體質量及臟器指數(shù)的影響(n＝6)Tab. 1 Effect of extracelluar polysaccharide of N. flagelliforme on the body weight and oganism indexes of mice(n＝6)

2.2 發(fā)菜胞外多糖對小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的影響

單核巨噬細胞的廓清指數(shù)α 能夠反映它的吞噬能力；廓清指數(shù)α 值越大，單核巨噬細胞的吞噬能力越強．發(fā)菜胞外多糖對小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的影響見表2．

表2 發(fā)菜胞外多糖對小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的影響(n＝6)Tab. 2 Effect of extracelluar polysaccharide of N. flagelliforme on the phagophagocytic ability of mononuclear phagocyte(n＝6)

由表2可知：實驗組的廓清指數(shù)α 均比空白組的高，低劑量組與空白組有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與空白組具有極顯著性的差異(P＜0.01)．這表明發(fā)菜胞外多糖能極顯著增加小鼠單核巨噬細胞的吞噬能力．

2.3 發(fā)菜胞外多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響

巨噬細胞是重要的免疫細胞，具有多種免疫功能，如吞噬外來的小顆粒物質、呈遞抗原、分泌細胞因子等．一般情況下巨噬細胞處于休眠狀態(tài)，其吞噬能力很弱，當受到一些免疫增強劑激活以后，巨噬細胞能夠抑制腫瘤細胞的增長及轉移，表現(xiàn)出更強的殺菌、溶癌、吞噬及胞飲能力[15]．發(fā)菜胞外多糖對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響如圖1所示．由圖1可知：與空白組相比，高劑量組的發(fā)菜胞外多糖使腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力增強了20%左右，低劑量組對巨噬細胞的吞噬能力無顯著性影響．這說明發(fā)菜胞外多糖能在一定程度上增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力．

圖1 發(fā)菜胞外多糖對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響(n＝6)Fig. 1 Effect of extracelluar polysaccharide of N. flagelliforme on the peritoneal macrophage neutral red(NR)(n＝6)

2.4 發(fā)菜胞外多糖對小鼠NK細胞自然殺傷活性的影響

NK細胞為機體非特異性免疫細胞，具有抗感染和抗腫瘤的作用，被激活后可以分泌多種細胞因子．它是通過識別靶細胞上相應活化受體和抑制性受體的配體而區(qū)分正常和異常(受到感染或發(fā)生惡性轉化)的細胞，發(fā)揮其免疫監(jiān)視作用．發(fā)菜胞外多糖對正常小鼠NK細胞自然殺傷活性的影響如圖2所示.

圖2 發(fā)菜胞外多糖對正常小鼠NK細胞自然殺傷活性的影響(n＝6)Fig. 2 Effect of extracelluar polysaccharide of N. flagelliforme on NK cell activity(n＝6)

由圖2可知：高、低劑量的發(fā)菜胞外多糖均能增加小鼠NK細胞的自然殺傷活性，其中高劑量組多糖能極顯著增加NK細胞的自然殺傷活性(P＜0.01).這說明發(fā)菜胞外多糖能夠增強小鼠NK細胞的自然殺傷活性，從而提高小鼠非特異性免疫能力．

2.5 發(fā)菜胞外多糖對小鼠脾細胞增殖的影響

脾臟是機體最大的免疫器官，脾臟中含T淋巴細胞和B淋巴細胞，均為機體的特異性免疫細胞，脾細胞增殖情況可以反映T淋巴細胞及B淋巴細胞的免疫能力[16]．發(fā)菜胞外多糖對脾細胞增殖的影響如圖3所示．

圖3 發(fā)菜胞外多糖對脾細胞增殖的影響(n＝6)Fig. 3Effect of N. flagelliforme extracelluar polysaccharide on the spleen cell proliferation of mice(n＝6)

由圖3可知：高、低劑量組的發(fā)菜胞外多糖對絲裂原ConA刺激的T淋巴細胞的增殖均有一定的促進作用，但是效果不顯著．對LPS刺激的B淋巴細胞的增殖無影響．這說明多糖對絲裂原ConA的誘導產生了的正效應，而對絲裂原LPS的誘導基本沒有反應．發(fā)菜胞外多糖對小鼠的脾質量也有一定的增加，這有可能與多糖能一定程度刺激T淋巴細胞的分化有關．

2.6 發(fā)菜胞外多糖對DNFB誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應(DTH)的影響

DTH是由T淋巴細胞介導的超敏反應．DNFB是一種半抗原，當與皮膚蛋白接觸后形成完全抗原，完全抗原能夠刺激T淋巴細胞的活化．當DNFB涂在小鼠右耳時，由遲發(fā)型超敏反應(DTH)引起的小鼠耳腫脹會持續(xù)4～7d，耳腫脹程度可以反映遲發(fā)型超敏反應的程度．由表3可知，與空白組相比低劑量組的耳腫脹程度無顯著變化，高劑量組的多糖能在一定程度上增強小鼠的耳腫脹程度．這說明多糖能在一定程度上增加小鼠免疫能力．

表3 發(fā)菜胞外多糖對小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響(n＝6)Tab. 3Effect of extracelluar polysaccharide of N. flagelliforme on the delay-type hypersensitivity of mice (n＝6)

3 結 論

人工培養(yǎng)的發(fā)菜胞外多糖對小鼠DTH和脾細胞增殖沒有顯著性的影響，說明發(fā)菜胞外多糖不能直接通過作用于機體的特異性免疫系統(tǒng)來增強機體的免疫能力．但它能通過作用于小鼠單核巨噬細胞、腹腔巨噬細胞和NK細胞來提高機體非特異性免疫水平，從而起到增強機體免疫能力的作用．這為發(fā)菜胞外多糖作為一種功能性食品的進一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據．

［1］ Kanekiyo K，Lee J B，Hayashi K，et al. Isolation of an antiviral polysaccharide，nostoflan，from a terrestrial cyanobacterium，Nostoc flagelliforme[J]. Journal of Natural Products，2005，68(7)：1037–1041.

［2］ Kanekiyo K，Hayashi K，Lee J B，et al. Structure and antiviral activity of an acidic polysaccharide from an edible blue-green alga，Nostoc flagelliforme[J]. Yakugaku Zasshi：Journal of the Pharmaceutical Society of Japan，2008，128(5)：725–731.

［3］ 陳雪峰，李一當，賈士儒. 發(fā)菜多糖的提取、純化鑒定及理化特性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(10)：174–177.

［4］ 湯俊，胡征宇. 3種念珠藻多糖對自由基的清除作用[J]. 武漢植物學研究，2006，24(1)：63–66.

［5］ Jia S，Yu H，Lin Y，et al. Characterization of extracellular polysaccharides from Nostoc flagelliforme cells in liquid suspension culture[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12(3)：271–275.

［6］ Han P，Sun Y，Wu X，et al. Emulsifying，flocculating，and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，172(1)：36–49.

［7］ 姚瑾，賈士儒，岳思君，等. 發(fā)菜及其提取物清除自由基的作用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(3)：45–48.

［8］ Staub A M. Removal of protein-Sevag method[J]. Methods in Carbohydrate Chemistry，1965，5(2)：5–6.

［9］ Yang X，Guo D，Zhang J，et al. Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide[J]. International Immunopharmacology，2007，7(3)：401–408.

［10］ Weeks B A，Keisler A S，Myrvik Q N，et al. Differential uptake of neutral red by macrophages from three species of estuarine fish[J]. Developmental & Comparative Immunology，1987，11(1)：117–124.

［11］ Ye L B，Zheng X，Zhang J，et al. Biochemical characterization of a proteoglycan complex from an edible mushroom Ganoderma lucidum fruiting bodies and its immunoregulatory activity[J]. Food Research International，2011，44(1)：367–372.

［12］ 陳成章. 免疫毒理學[M]. 鄭州：鄭州大學出版社，2008：440–441．

［13］ Li J，Ji L，Sun L，et al. Differential uptake of neutral red by macrophages from three species of estuarine fish[J]. Carbohydrate Polymers，2012，87(1)：551–556.

［14］ Huang S，Ning Z. Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and its immune enhancement activity[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，47(3)：336–341.

［15］ Fishman M，Gunther G. Induction of tumor cell resistance to macrophage-mediated lysis by preexposure to nonactivated macrophages[J]. Cellular Immunology，1986，99(1)：241–256．

［16］ Yang T，Jia M，Meng J，et al. Immunomodulatory activity of polysaccharide isolated from Angelica sinensis[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2006，39(4/5)：179–184.

責任編輯：周建軍

Effect of Extracellular Polysaccharide from Liquid-cultured Nostoc flagelliforme on the Immune Abilities of Mice

HOU Maoxia，DAI Yujie，F(xiàn)U Honglei，YUE Lifang，MAN Shuli

(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The effect of extracellular polysaccharides(EPS)from liquid-cultured Nostoc flagelliforme on the specific and non-specific immune abilities of mice has been investigated. It was found that the phagocytic index of carbon granular clearance and the activity of NK cells increased significantly(P＜0.05)in a dosage dependent manner in the range of 50-100mg/(kg·d). The phagocytic ability of the peritoneal macrophages was also improved to some extend. All this indicated EPS could promote the non-specific immunity effectively. The organism indexes in mice，the delayed-type hypersensitivity(DTH)induced by dinitrofluorobenzene and the proliferation of lymphocytes in the low and high doses of EPS showed no significant difference compared with those of the control group，which suggested that EPS from liquid-cultured Nostoc flageliforme has a little effect on the specific immune abilities of mice.

Nostoc flagelliforme；EPS；NK cell；DTH；non-specific immunity；splenic lymphocytes

R979.5

A

1672-6510(2014)04-0016-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.004

2013–12–01；

2014–03–09

國家自然科學基金資助項目(31271809)

侯茂霞（1989—），女，四川人，碩士研究生；通信作者：戴玉杰，教授，yjdai@126.com.