王 楠，李曉凡，莊春雨，徐 堯，菅若蕾，張同存

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

大鼠胚胎神經干細胞體外培養(yǎng)及誘導分化

王 楠，李曉凡，莊春雨，徐 堯，菅若蕾，張同存

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

神經干細胞在理論研究和臨床應用上有著廣泛的前景．本文主要在體外分離培養(yǎng)SD大鼠胚胎前腦的神經干細胞，并分別用去除生長因子或添加全反式維甲酸(ATRA)兩種方法誘導分化．免疫熒光染色技術分別檢測細胞巢蛋白(Nestin)的表達及分化后β微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達，計算分化率．結果顯示：細胞生長狀態(tài)良好，呈Nestin表達陽性．分化后可獲得β-Ⅲtubulin及GFAP表達陽性的細胞，其中ATRA誘導方法獲得β-Ⅲtubulin陽性細胞較多．

神經干細胞；SD大鼠胚胎；擴增；分化

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)存在于哺乳動物胚胎及成體的中樞神經系統(tǒng)，具有自我增殖和多潛能分化能力，在一定條件下，可以分化成為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞．1992年Spiliotopoulos 等[1]從成年小鼠紋狀體分離得到能在體外不斷增殖且具有多種分化潛能的細胞群，表明在成熟的神經系統(tǒng)中存在神經干細胞．當神經系統(tǒng)受到各種傷害時，神經干細胞能被誘導分化為某種神經元來替代損傷的神經細胞，達到重建結構和恢復功能的目的[1-2]．因此，神經干細胞為中樞神經系統(tǒng)損傷、神經退行性疾病等的細胞移植替代治療以及基因治療提供了一條新的思路與途徑[1-3]，在理論研究和臨床應用上有著廣泛的前景，是當今生命科學領域研究的熱點；但要將神經干細胞應用于臨床實踐還有許多問題尚待解決．由于成年動物體內不能直接獲得足夠的神經干細胞，因此體外建立分離、培養(yǎng)和鑒定神經干細胞及定向誘導分化為特定神經元的方法就成為研究和應用神經干細胞最基礎而關鍵的工作．本文目的在于分離培養(yǎng)Sprague Dawley(SD)大鼠胚胎神經干細胞，改進培養(yǎng)條件，大量擴增，同時在體外利用去除生長因子或加入全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)兩種方法進行誘導分化，比較兩種誘導分化獲得神經元與神經膠質細胞情況，希望為進一步的研究和使用NSCs奠定理論和實驗基礎．

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

懷孕14～16d健康SD大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK–(軍)2012–0004，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準．

1.1.2主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)基添加因子，Gibco公司；堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)，Peprotech公司；Accutase?solution細胞分散液，Sigma公司；多聚賴氨酸，EMS公司；巢蛋白(Nestin)多克隆抗體，博奧森公司；β微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)多克隆抗體、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體，Abcam公司；FITC標記山羊抗兔IgG、TRITC標記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司．

1.2方法

1.2.1神經干細胞的分離和原代培養(yǎng)

將SD大鼠孕鼠(孕齡14～16d)引頸處死，無菌條件下取出子宮，用無菌PBS沖洗后分離胚胎的前腦組織，仔細去除血管和腦膜，用眼科剪將前腦組織剪成1mm3左右的碎塊，將其放入含有4℃預冷的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基的離心管中，用Pasteur吸管反復吹打20～30次；靜置5min后在沉淀的組織塊中以1∶1的比例加入Accutase?solution細胞分散液和DMEM/F12基礎培養(yǎng)基，反復吹打后置于37℃培養(yǎng)箱中消化10min，向離心管中加入2mL含F(xiàn)BS胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應，取上清液200目濾網過濾，1,000r/min離心5min，棄上清液，加入含有20,ng/mL EGF、10,ng/mL bFGF和2%B27的DMEMF12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)重懸細胞，經苔盼藍染色，調整細胞密度為1×105mL–1，接種至100mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)．每3d半量換液1次．

1.2.2神經干細胞的傳代培養(yǎng)

神經干細胞原代培養(yǎng)7～10d后，收集形成的細胞球1,000r/min離心5min，棄上清液，利用Accutase?solution細胞分散液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)．

1.2.3神經干細胞免疫熒光鑒定

收集培養(yǎng)至第3代的神經干細胞，接種于多聚賴氨酸包被的24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24h后，常規(guī)方法進行免疫熒光檢測．首先4%多聚甲醛室溫固定30min；PBS清洗細胞后加入0.25%的透膜劑Triton-100(PBS稀釋)處理細胞40min；5%正常山羊血清封閉液封閉1h；去除血清，滴加一抗(兔抗鼠Nestin抗體)，37℃孵育2h；PBS清洗后加入相應的二抗(TRITC標記的山羊抗兔IgG)，同時用DAPI染核，室溫避光孵育90min；PBS清洗后激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus公司)下觀察并照相．

1.2.4神經干細胞的誘導分化

收集培養(yǎng)至第3代的神經干細胞，PBS洗滌3次，離心后重懸細胞，Pasteur吸管輕輕吹打進行機械分離，使其分散成較小細胞團，以1×104mL–1細胞密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中(孔板預先用多聚賴氨酸處理)，分別用去因子和添加ATRA兩種方法進行誘導培養(yǎng)．去因子誘導組：加入含2% B27神經誘導培養(yǎng)基DMEM/F12；ATRA誘導組：加入完全培養(yǎng)基并添加3μmol/L ATRA．置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)．每3d半量換液1次，逐日觀察并記錄細胞形態(tài)．

1.2.5免疫熒光染色鑒定分化后的細胞

將誘導分化12d的細胞進行免疫熒光染色，使用一抗為兔抗鼠β-Ⅲtubulin、GFAP抗體，使用相應的二抗為TRITC和FITC標記的山羊抗兔IgG，同時加入DAPI染細胞核，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并照相．隨機取20個視野，以DAPI染色的細胞核數(shù)為總細胞數(shù)，分別計數(shù)β-Ⅲtubulin和GFAP陽性細胞數(shù)，計算神經元、神經膠質細胞的分化率．

1.2.6統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件計算，實驗數(shù)據均以±s表示.

2 結果與分析

2.1神經干細胞原代分離培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

剛剛提取出的神經干細胞接種到培養(yǎng)皿中只有少量細胞集落以及大量的組織碎塊等．細胞培養(yǎng)1～2d，部分細胞開始聚集并懸浮生長，不能增殖的細胞以及單個的死亡的神經干細胞沉到培養(yǎng)皿底部(圖1(a))．細胞培養(yǎng)3～5d，細胞逐漸增殖成大小不一、形狀不規(guī)則的細胞團(圖1(b))．細胞培養(yǎng)6～7d，細胞集落逐漸形成由幾十至幾百細胞組成的細胞球，邊緣發(fā)亮，遮光性強(圖1(c))．傳代培養(yǎng)主要利用Accutase?solution細胞分散液進行，傳代后的細胞球生長更為迅速，培養(yǎng)液中的雜細胞幾乎去除，培養(yǎng)背景逐漸清亮，細胞球直徑更大，細胞球形狀更加規(guī)則．

2.2神經干細胞的鑒定

對傳代至3代的神經干細胞進行鑒定，觀察神經巢蛋白的染色情況，結果見圖2．結果顯示，傳代后的神經干細胞Nestin的檢測結果呈陽性．這說明從孕14d SD大鼠胚胎的前腦中分離獲得的細胞為神經干細胞，表達神經干細胞的特異性標志Nestin，并且多次傳代后仍具有很好的干性．

圖1　神經干細胞體外擴增培養(yǎng)的形態(tài)Fig. 1 Morphological pictures of neurospheres isolated from rat embryos

圖2　Nestin免疫熒光鑒定神經干細胞Fig. 2 Immunofluorescent staining for Nestin in neural stem cells

2.3神經干細胞的誘導分化及鑒定

收集培養(yǎng)至第3代的神經干細胞，利用去除EGF和bFGF兩種生長因子方法誘導分化，結果如圖3所示．

圖3　分化的神經干細胞的形態(tài)圖Fig. 3 Morphological pictures of differentiated NSCs

誘導1～3d，少量細胞從細胞球邊緣分離出來，呈貼壁生長形態(tài)(圖3(a))；4～7d，細胞球邊緣貼壁細胞逐漸增多，呈放射狀分布，貼壁生長的細胞開始有絲狀物質出現(xiàn)(圖3(b))；8～12d，絕大多數(shù)細胞游走出來，細胞球失去形態(tài)，細胞分散為單細胞層，細胞突起繼續(xù)增多變長，細胞與細胞之間交互形成網狀，并且伴有神經絲出現(xiàn)(圖3(c))．

添加ATRA誘導1～3d，有少量細胞分離出來，貼壁生長，并且伴有少量神經絲出現(xiàn)(圖3(d))；4～7d，更多細胞分離出來貼壁生長，更多神經絲出現(xiàn)，細胞球體積縮小(圖3(e))；8～12d，幾乎所有細胞分離出來貼壁生長，分離出的細胞與細胞之間交互形成網狀，有大量的神經絲生成(圖3(f))．

經去除生長因子EGF和bFGF(圖4(a)—圖4(d))以及添加ATRA(圖5(a)—圖5(d))這兩種誘導方法誘導分化12d，取細胞進行β-Ⅲtubulin和GFAP的免疫熒光染色．免疫熒光結果顯示，經兩種誘導方法誘導后，神經球中細胞可以分化為神經元、神經膠質細胞，表達神經元的特異性標志物β-Ⅲtubulin和神經膠質細胞的特異性標志物GFAP．這進一步證實了從SD大鼠胚胎中分離得到的細胞具有向神經元和神經膠質細胞分化的能力．

圖4　免疫熒光鑒定去除生長因子誘導12d的GFAP和β-Ⅲtubulin陽性細胞Fig. 4 Immunofluorescent staining identified GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells 12days after removing the growing factors

圖5　免疫熒光鑒定添加ATRA誘導12d的GFAP和β-Ⅲtubulin陽性細胞Fig. 5 Immunofluorescent staining identified GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells 12 days after adding ATRA

將兩種誘導結果進行比較，結果如圖6所示．發(fā)現(xiàn)去除生長因子EGF和bFGF組中，神經膠質細胞標志物GFAP陽性細胞占(58.70±2.14)%；神經元細胞標志β-Ⅲtubulin陽性細胞占(37.47±3.37)%．在添加ATRA誘導組中，(52.80±5.70)%細胞呈現(xiàn)GFAP陽性；(41.59±4.79)%細胞呈現(xiàn)β-Ⅲtubulin陽性．因此，與去除生長因子相比，在添加ATRA誘導神經干細胞分化過程中，神經元細胞數(shù)較多．

圖6　GFAP和β-Ⅲtubulin陽性細胞數(shù)的分化率Fig. 6 Percentage of GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells

3 討 論

神經干細胞在發(fā)育過程中其自我更新、增殖和分化的調控機制非常復雜，受很多因素影響．體外培養(yǎng)的神經干細胞主要與其所在的微環(huán)境密切相關．本實驗采用無血清培養(yǎng)基，加入能夠刺激神經干細胞生長的3種因子bFGF、EGF和B27，對神經干細胞進行體外的增殖培養(yǎng)．EGF主要作用是促進神經干細胞的長期存活；而bFGF則可能對于神經干細胞向神經元和部分程度向膠質細胞分化起到一定的作用；B27添加劑含有多種促進干細胞生長和存活的微量元素．本實驗培養(yǎng)的細胞球呈懸浮生長，細胞圓潤飽滿，活力狀態(tài)好，經過多次連續(xù)傳代，仍可形成神經球，表現(xiàn)出良好的持續(xù)增殖能力．

目前常用的分離方法有酶解法[1,4]和機械吹打法[3,5]，若使用機械吹打法需要掌握吹打的時間、力度和次數(shù)等條件，而用酶解法操作簡單、方便，但需要掌握酶解的時間．因此，本實驗采用酶解法與機械吹打法相結合的方法，可以避免機械吹打法以及酶解法過度導致的細胞損傷的缺點，較好地對NSCs進行分離及傳代培養(yǎng)．傳代后的細胞生長狀況良好，從細胞形態(tài)上觀察與原代細胞相同，經免疫熒光染色巢蛋白表達呈陽性．巢蛋白(Nestin)是一種中間絲蛋白，又稱為細胞骨架蛋白，該蛋白只在多潛能的神經外胚層細胞表達，僅在胚胎早期神經上皮表達，目前是公認的神經干細胞的標志物．

ATRA通過維甲酸受體RARs對神經細胞的發(fā)育、分化產生重要的影響，能夠上調某些神經營養(yǎng)因子如腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)受體的表達而促進神經干細胞的發(fā)育．Schuldiner等[6]研究表明，ATRA具有誘導ES細胞向神經膠質細胞分化或可使ES細胞分化為有功能的神經元．Rasmussen等[7]發(fā)現(xiàn)，利用ATRA與神經生長因子BDNF協(xié)同作用能夠使神經始祖細胞誘導成為神經元．Takahashi等[8]證明了ATRA可以與神經生長因子協(xié)同作用使人的神經干細胞分化為神經元．Bain等[9]證實了ATRA能誘導ES細胞分化為神經元樣細胞．另外，有很多研究證實去除EGF和bFGF兩種生長因子可以誘導神經干細胞成為神經元．Deierborg等[10]構建大鼠的腦缺血模型，并將得到的神經干細胞利用去因子的方式誘導分化為神經元和神經膠質細胞．但也有報道[11]認為，bFGF在神經干細胞的存活、增殖和分化上有著促進作用．

綜上所述，本實驗分離培養(yǎng)的神經干細胞可穩(wěn)定增殖、長期傳代．在去除生長因子或加入ATRA的條件下可誘導神經干細胞分化為成熟的神經元和神經膠質細胞，說明從SD大鼠前腦中分離獲得的神經干細胞具有自我更新和多向分化潛能．并且，加入ATRA可以大大提高向神經元細胞分化的比例，為高效誘導神經干細胞定向分化研究提供新思路．神經干細胞的成功分離和體外培養(yǎng)對通過細胞移植治療中樞神經系統(tǒng)疾病具有重要意義．

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責任編輯：郎婧

Culture and Differentiation of Rat Embryonic Neural Stem Cells in Vitro

WANG Nan，LI Xiaofan，ZHUANG Chunyu，XU Yao，JIAN Ruolei，ZHANG Tongcun

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Neural stem cells(NSCs)have great potential in basic research and clinical application. In this study，NSCs were isolated from the forebrain of SD rat embryos，cultured in vitro，and then induced to differentiate by removing the growing factors or adding all-trans retinoic acid(ATRA). Immunofluorescence technology was used to test the expression of Nestin and differentiation marker β-Ⅲtubulin and GFAP，and then the percentage of differentiated cells were calculated. The results show that the isolated cells can be amplified in vitro and exhibit Nestin positive expression. The differentiated cells expressed β-Ⅲtubulin and GFAP. Compared with growing factor withdrawal，addition of ATRA resulted in more β-Ⅲtubulin positive cells.

neural stem cells；SD rat embryo；proliferation；differentiation

Q28

A

1672-6510(2014)04-0001-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.001

2013–11–27；

2014–01–08

國家自然科學基金資助項目(31171303)；教育部科技研究重點項目(212010)

王 楠（1979—），女，吉林人，教授；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.