程 玉，潘理會(huì)，劉海旺，李春輝

細(xì)胞間隙連接通訊 (GJIC)是由相鄰細(xì)胞間通過間隙連接所介導(dǎo)的一種通訊方式，其通道的主要成分是間隙連接蛋白，其中間隙連接蛋白43(Cx43)是目前研究最廣泛的連接蛋白［1－2］。磷脂酰肌醇 3－ 激酶(PI3K)存在于細(xì)胞質(zhì)的復(fù)合體，是磷脂激酶家族中的重要成員，在磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)傳導(dǎo)通路中是始動(dòng)因子，并且在蛋白激酶B(Akt)的激活過程中起著十分重要的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路的活化可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［3－4］。本研究通過檢測正常胃組織與胃癌組織中Cx43與PI3K的表達(dá)，分析胃癌組織中Cx43與PI3K的關(guān)系，以探討細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的作用，從而為探索胃癌的發(fā)生機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年7月—2013年2月行手術(shù)切除癌組織的胃癌患者60例，其中男48例，女12例;年齡45～77歲，平均 (58.5±10.0)歲;中～高分化者24例，低分化者36例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例;Ⅰ/Ⅱ期者28例，Ⅲ/Ⅳ者32例;癌組織穿透漿膜者48例，未穿透漿膜者12例?；颊咝g(shù)前均未行放化療治療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為胃腺癌，且相應(yīng)癌旁組織均未見有癌細(xì)胞累及。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人Cx43抗體 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，兔抗人PI3K(P85α亞型)濃縮型多克隆抗體 (工作濃度均為1∶100，武漢博士德生物工程有限公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)試劑盒及DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物 (北京賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成)。Cx43基因上游引物為:5'－TCTCGCCTATGTCTCCTCCTGG－3'，下游引物為:5'－AGTTAGAGATGGTGCTTCCCGC－3'，擴(kuò)增片段為156 bp;P85α亞型基因上游引物為:5'－TGCTATGCCTGCTCTGTAGTGGT－3'，下游引物為:5'－GTGTGACATTGAGGGAGTCGTTG－3'，擴(kuò)增片段為175 bp;內(nèi)參基因 (β－actin)上游引物為:5'－A GCGGGAAATCGTGCGTGAC－3'，下游引物為:5'－ACATCTGCTGGAAGGTGGAC－3'，擴(kuò)增片段為453 bp。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本采集 收集手術(shù)切除的胃癌組織60份，并收集患者距癌邊緣10 cm以上的正常胃組織25份。所有標(biāo)本離體后立即平均分為兩份，一份在離體后30 min內(nèi)儲(chǔ)存于－80℃冰箱里待用;另一分離體后立即置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片 (4 μm厚)，切片以二甲苯脫蠟及系列乙醇脫水;PBS緩沖液沖洗5 min后，以3%H2O2孵育10 min(室溫);PBS緩沖液沖洗6 min/次，沖洗2次后，在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù);加Cx43、PI3K抗體，在37℃濕盒中溫育60 min后，在濕盒中4℃過夜;PBS緩沖液洗5 min/次，沖洗3次后，滴加Ⅱ抗快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育15 min;PBS緩沖液沖洗5 min/次，沖洗3次后，使用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色5 min;蒸餾水沖洗終止顯色后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核;封片，顯微鏡下觀察。另外，用PBS緩沖液替代Cx43和PI3K抗體，其余染色步驟相同，制作切片作為陰性對(duì)照;用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對(duì)照。Cx43陽性表達(dá)染色呈黃色至棕黃色，在正常胃組織中主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。PI3K陽性表達(dá)染色呈黃色至棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。在染色均勻的區(qū)域，選取5個(gè)高倍鏡視野 (×400倍):(1)按陽性細(xì)胞百分率 (A值)評(píng)分:1%～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分;(2)按染色強(qiáng)度 (B值)評(píng)分:不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分相加≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.3.3 RT－PCR 采用Triozol試劑盒分別提取胃癌及正常胃組織的RNA，分析其完整性、純度和濃度，并作RT－PCR檢測。Cx43的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、58℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)35次;72℃延伸5 min。PI3K的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、58℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)35次;72℃延伸5 min。β－actin的循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、55℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)30次;72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測，相應(yīng)位點(diǎn)出現(xiàn)單一電泳條帶為陽性表達(dá)。以β－actin作為內(nèi)參照，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度測定。

1.4 觀察指標(biāo) 比較正常胃組織及胃癌組織中Cx43、PI3K的陽性表達(dá)率，Cx43 mRNA、PI3K mRNA的相對(duì)表達(dá)量 (通過計(jì)算Cx43 mRNA、PI3K mRNA與β－actin產(chǎn)物的光密度比值得出)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以 ()表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用2×2列表資料的χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算Pearson列聯(lián)系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43、PI3K在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況 Cx43在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為33.3% (20/60)，低于在正常胃組織中的陽性表達(dá)率100.0%(25/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=31.48，P=0.00)。PI3K在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為86.7%(52/60)，高于在正常胃組織中的陽性表達(dá)率20.0%(5/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=35.50，P=0.00)。Cx43、PI3K在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況見圖1～2。

2.2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43、PI3K的表達(dá)情況 胃癌組織中Cx43、PI3K的表達(dá)與胃癌的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) (P＜0.05)。Cx43在中～高分化胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。PI3K在中～高分化胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.3 Cx43 mRNA、PI3K mRNA在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況 胃癌組織中Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為 (0.53±0.07)，低于正常胃組織的 (0.71±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=12.76，P=0.00)。胃癌組織中PI3K mRNA的相對(duì)表達(dá)量為 (0.56±0.20)，高于正常胃組織的 (0.31±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.79，P=0.00)。Cx43 mRNA、PI3K mRNA電泳定性檢測結(jié)果見圖3～4。

圖1 Cx43在胃組織中的表達(dá) (免疫組化染色，×200)Figure 1 Cx43 positive expression in gastric mucosa

圖2 PI3K在胃組織中的表達(dá) (免疫組化染色，×200)Figure 2 PI3K positive expression in gastric mucosa

表1 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43、PI3K的表達(dá)情況〔n(%)〕Table 1 Cx43 and PI3K expression of gastric carcinoma in patients with diffirent clinical features

圖3 Cx43 mRNA電泳圖Figure 3 The electrophoresis of Cx43 mRNA

圖4 PI3K mRNA電泳圖Figure 4 The electrophoresis of PI3K mRNA

2.4 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達(dá)情況 Cx43 mRNA、PI3K mRNA的相對(duì)表達(dá)量與胃癌的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) (P＜0.05)。Cx43 mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。PI3K mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達(dá)情況 ()Table 2 Cx43 mRNA and PI3K mRNA expression of gastric carcinoma in diffirent clinical features

表2 不同臨床病理特征患者胃癌組織Cx43 mRNA、PI3K mRNA的表達(dá)情況 ()Table 2 Cx43 mRNA and PI3K mRNA expression of gastric carcinoma in diffirent clinical features

病理特征 例數(shù) Cx43 mRNA t值 P值 PI3K mRNA t值 P值分化程度4.47 0.00 2.44 0.03中～高分化 24 0.57±0.07 0.47±0.17低分化 36 0.48±0.05 0.65±0.19臨床分期 5.66 0.00 5.13 0.00Ⅰ/Ⅱ期 28 0.56±0.06 0.44±0.09Ⅲ/Ⅳ期 32 0.46±0.05 0.76±0.17浸潤深度 5.32 0.00 2.54 0.02穿透漿膜 48 0.45±0.06 0.68±0.21未穿透漿膜 12 0.55±0.06 0.49±0.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 4.63 0.00 3.71 0.00是35 0.45±0.05 0.77±0.21否25 0.55±0.06 0.49±0.14

2.5 胃癌組織中Cx43與PI3K表達(dá)的相關(guān)性分析 胃癌組織中Cx43與PI3K的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (P＜0.05，見表3)。

表3 胃癌組織中Cx43與PI3K表達(dá)的相關(guān)性分析 (例)Table 3 Correlation between Cx43 and PI3K expression in gastric carcinoma

3 討論

Cx43是連接蛋白家族中的重要一員，是構(gòu)成胃癌組織GJIC中主要的連接蛋白［5］。其對(duì)腫瘤生長的抑制被認(rèn)為是通過間隙連接 (GJ)散發(fā)一些生長抑制因子，如通過PKA(蛋白激酶A)系統(tǒng)參與GJ依賴的生長抑制。Tang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中與鄰近的正常細(xì)胞相比，Cx43的表達(dá)顯著降低;轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中Cx43較胃癌細(xì)胞中的Cx43表達(dá)顯著升高。提示Cx43的低表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于正常胃組織;Cx43 mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。提示Cx43可能與多種致癌因素共同參與了胃癌的發(fā)生，并影響了胃癌的生物學(xué)行為;且Cx43表達(dá)水平下降和間隙連接細(xì)胞間通訊功能異?？赡軈⑴c了胃癌惡性程度的進(jìn)展和癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

當(dāng)上游信號(hào)刺激細(xì)胞膜表面時(shí)，胞膜產(chǎn)生的位點(diǎn)與PI3K結(jié)合可產(chǎn)生一些磷脂，激活其下游的主要靶酶Akt，活化的Akt(磷酸化Akt)可介導(dǎo)各種類型的細(xì)胞生長、分化以及癌細(xì)胞的侵襲和癌基因的表達(dá)［7］。本研發(fā)現(xiàn)，PI3K在胃癌組織中的陽性表達(dá)率 (86.7%)高于在正常胃組織中的陽性表達(dá)率 (20.0%)，PI3K mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量也明顯高于正常胃組織。提示PI3K可能與胃癌的形成有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K在胃癌中的表達(dá)與分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān);PI3K mRNA在中～高分化胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于低分化胃癌組織，在臨床分期Ⅰ/Ⅱ期胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織，在浸潤深度穿透漿膜的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于未穿透漿膜的胃癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。表明PI3K的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程以及癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān);且其表達(dá)水平升高提示其可能成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

PI3K主要由1個(gè)催化亞基P110和1個(gè)調(diào)節(jié)亞基P85 組成［8］。P85 又分為 P85α、P85β、P85γ 三種，其N末端含有1個(gè)SH3區(qū)和1個(gè)能與其他蛋白的SH3區(qū)結(jié)合的富含脯氨酸序列，其C末端含2個(gè)SH2區(qū)和1個(gè)位于2個(gè)SH2區(qū)之間可結(jié)合P110的結(jié)構(gòu)區(qū)。P110除具有磷脂酰肌醇激酶活性外，還具有絲/蘇氨酸 (Ser/Thr)蛋白激酶活性，可催化自身和其他接頭蛋白磷酸化。有文獻(xiàn)報(bào)道，血小板源性生長因子 (PDGF)能通過PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)GJIC和Cx43的磷酸化過程，PI3K能調(diào)節(jié)PDGF誘導(dǎo)的蛋白激酶C(PKC)和絲裂原激活蛋白激酶途徑 (MAPK途徑)的過程［9］。已證實(shí)PKC途徑通過使Cx43的262和368位點(diǎn)磷酸化，而使GJ通道通訊功能下降［10］。MAPK途徑通過使 Cx43的255、279和282位點(diǎn)磷酸化，降低通道開放的頻率來抑制其通訊作用［11］。本研究結(jié)果表明，在胃癌組織中 Cx43與PI3K的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這可能是由于PI3K通過激活各種信號(hào)分子，而這些信號(hào)分子引起Cx43磷酸化，從而破壞GJIC，導(dǎo)致細(xì)胞間生長相互控制減弱，細(xì)胞過分克隆生長所致。這種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的相互作用可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究從蛋白和基因水平證實(shí)了Cx43在胃癌組織中低表達(dá)，PI3K在胃癌組織中高表達(dá)。二者均參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。Cx43與PI3K的表達(dá)在胃癌中呈負(fù)相關(guān)，不排除與樣本量較小有關(guān)，因此其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 Oktem G，Bilir A，Ayla S，et al.Role of intercellular communications in breast cancer multi cellular tumor spheroids after chemotherapy ［J］.Oncol Res，2006，16(5):225 －233.

2 Giepmans BN.Role of connexin43－interacting proteins at gap junctions［J］.Adv Cardiol，2006(42):41 －56.

3 Osaki M，Oshimura M，Ito H.PI3K－Akt pathway:its functions and alterations in human cancer［J］.Apoptosis，2004，9(6):667 －676.

4 Shaw RJ，Cantley LC.Ras.PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth［J］.Nature，2006，441(7092):424－430.

5 Xu CX，Jia Y，Yang WB，et al.Relationship between Helicobacter pylori infection and expression of connexin(Cx)32 and Cx43 genes in gastric cancer and gastric precancerous lesions［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(22):1523 －1527.

6 Tang B，Peng ZH，Yu PW，et al.Expression and significance of Cx43 and E－cadherin in gastric cancer and metastatic lymph nodes［J］.Med Oncol，2011，28(2):502 －508.

7 Abrahamsen H，Stenmark H，Platta HW.Ubiquitination and phosphorylation of Beclin1 and its binding partners:tuning class Ⅲ phosphatidylinositol 3 －kinase acticity and tumor suppression ［J］.FEBS Lett，2012，586(11):1584－1591.

8 Vogt PK，Hart JR，Gymnopoulos M，et al.Phosphatidylinositol3－kinase:the oncoprotein ［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010(347):79－104.

9 Yao J，Morioka T，Oite T.PDGF regulates gap junction communication and connexin43 phosphorylation by PI3－Kinase in mesangial cells［J］.Kidney International，2000，57(5):1915 －1926.

10 Solan JL，Lampe PD.Connexin43 in LA－25 cells with active v－src is phosphorylated on Y247，Y265，S262，S279/282，and S368 via multiple signaling pathways ［J］.Cell Commun Adhes，2008，15(1):75－84.

11 Sáez JC，Nairn AC，Czernik AJ，et al.Phosphorylation of connexin43 and the regulation of neonatal rat cardiac myocyte gap junctions［J］.J Mol Cell Cardiol，1997，29(8):2131 －2145.