邱玲玲，胡中揚(yáng)，楊錫榮，王 倩，劉 佳，宋 治

原發(fā)性高血壓病是遺傳易患性與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的慢性復(fù)雜疾病，是心腦血管疾病的獨立危險因素。全球原發(fā)性高血壓病患病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，2000年有26.4%的成人患有高血壓，預(yù)計到2025年總患病率將達(dá)到29.2%［1］。超重及肥胖是原發(fā)性高血壓病的危險因素已得到廣泛認(rèn)知，但目前國內(nèi)外對與肥胖有關(guān)的基因與原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性研究較少。位于黑素皮質(zhì)素受體 －4基因 (melanocortin－4 receptor gene，MC4R)附近的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點rs17782313是全基因組關(guān)聯(lián)分析 (genome wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)的肥胖相關(guān)基因位點。Loos等［2］通過對16 876例大樣本的薈萃分析發(fā)現(xiàn)該位點與體質(zhì)量呈正相關(guān)。我國學(xué)者在對3 077例年齡在6～18歲的樣本研究中發(fā)現(xiàn)肥胖易感位點如脂肪量和肥胖相關(guān)基因 (fat mass and associated gene，F(xiàn)TO)與高血壓相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)MC4R rs17782313位點多態(tài)性與高血壓的關(guān)系。有研究認(rèn)為該位點與導(dǎo)致高血壓發(fā)病的危險因素相關(guān)［3］。本研究旨在通過檢測湖南長沙地區(qū)漢族人群與肥胖相關(guān)的rs17782313位點多態(tài)性，進(jìn)而從遺傳學(xué)角度探討該位點與長沙地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2011年6月—2012年7月選取在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院住院的原發(fā)性高血壓病患者及體檢中心體檢健康者共768例，分為高血壓組 (440例)和對照組 (328例)。高血壓組患者間彼此無親緣關(guān)系，其中男258例、女182例;平均年齡 (63.2±10.5)歲;均符合1999年世界衛(wèi)生組織/國際高血壓協(xié)會診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］:未服降壓藥的情況下收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mm Hg或已確診為高血壓并服用降壓藥。排除繼發(fā)性高血壓、慢性肝腎功能不全、惡性腫瘤、先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病患者。對照組為無親緣關(guān)系的健康個體，其中男193例、女135例;平均年齡 (61.4±10.2)歲。高血壓組和對照組均為長沙地區(qū)漢族人群，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料及標(biāo)本采集 收集一般臨床資料〔性別、年齡、體質(zhì)量、體質(zhì)指數(shù) (BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓 (DBP)、總膽固醇 (TC)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、三酰甘油 (TG)、尿酸 (UA)、空腹血糖(FBG)〕。受試者禁食12～14 h后，抽取肘靜脈血約5 ml，加入到乙二胺四乙酸二鉀 (EDTA－K2)抗凝試管中，置于－20℃冰箱中儲存待用。

1.2.2 基因組DNA提取 取儲存的肘靜脈血300 μl經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解后嚴(yán)格按DNA提取試劑盒 (北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)說明書提取基因組DNA，并置于－20℃冰箱保存。

1.2.3 引物設(shè)計和合成 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)和單堿基延伸反應(yīng)引物均由AssayDesigner 3.1軟件包設(shè)計，由大連寶生物工程有限公司合成。rs17782313 PCR上游引物為:ACGTTGGATGCTTAAATGTCACCTTCCCCC，下游引物為:ACGTTGGATGAGAAGTTTAAAGCAGGAGAG，單堿基延伸反應(yīng)引物為:AGCTTTTCTTGTCATTTCCATC。

1.2.4 基因多態(tài)性檢測 采用PCR及飛行時間質(zhì)譜技術(shù) (MALDI－TOF－MS)對rs17782313位點進(jìn)行檢測。PCR及MALDI－TOF－MS主要步驟如下:(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng):①PCR反應(yīng)體系為基因組DNA 10 ng，引物0.1 μmol，4 × dNTP 500 μmol，Taq 酶 1 Unit，10 × Taq酶緩沖液0.5 μl，MgCl21.625 mmol。②擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性15 min;94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行45次循環(huán)，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(2)蝦堿性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase，SAP)反應(yīng):堿性磷酸酶消化PCR擴(kuò)增后剩余的dNTP及殘留引物。(3)單堿基延伸反應(yīng):①反應(yīng)體系為生化分析型超純水0.619 μl，特異性終止反應(yīng)物0.2 μl，延伸 反 應(yīng) 引 物 0.94 μl，iPLEX 緩 沖 液 0.2 μl，iPLEX酶0.041 μl及經(jīng)純化后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物7 μl，總體積9 μl。②反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30 s;94℃變性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共進(jìn)行40次循環(huán)，其中52℃退火5 s及80℃延伸5 s進(jìn)行5次循環(huán)，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(4)去鹽及上機(jī)檢測:將上一步的反應(yīng)產(chǎn)物加入陽離子交換樹脂完成去鹽，將產(chǎn)物點樣后利用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，并使用Mass ARRAY Typer軟件分析基因分型數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料以 ()表示，采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;數(shù)量性狀 (QTL)位點分析采用單因素線性回歸分析;高血壓的危險因素采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組和對照組臨床資料比較 兩組的年齡、體質(zhì)量、BMI、SBP、DBP、TC、LDL－C、TG、UA、FBG比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);兩組的性別構(gòu)成、HDL－C比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 rs17782313位點基因型分布及等位基因頻率比較

經(jīng)PCR及MALDI－TOF－MS技術(shù)能檢測到基因型的樣本高血壓組為435例，對照組為321例，得到rs17782313位點基因型為 CT、CC、TT(見圖1～3)。高血壓組和對照組的基因分布頻率均符合Hardy－Weinberg平衡檢驗(χ2=0.928、1.464，P=0.335、0.226)，說明本實驗所選擇的樣本具有群體代表性。高血壓組和對照組基因型分布和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

圖1 rs17782313位點 CT基因型 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 1 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CT of rs17782313

圖2 rs17782313位點 CC基因型MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 2 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CC of rs17782313

2.3 QTL位點單因素線性回歸分析 以MC4R基因rs17782313位點為自變量，將表1各代謝指標(biāo)依次作為因變量，分析各代謝指標(biāo)與rs17782313位點是否存在線性回歸關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅TC與rs17782313位點存在線性回歸關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (r=0.08，β=0.101，P=0.032)。

2.4 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析 以有無高血壓作為因變量，以性別、超重和肥胖、高脂血癥(分別為高三酰甘油血癥、高膽固醇血癥、高低密度脂蛋白血癥)、C等位基因作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超重和肥胖、高三酰甘油血癥、C等位基因是原發(fā)性高血壓病的獨立危險因素 (P＜0.05，見表3)。

圖3 rs17782313位點 TT基因型MALDI－TOF－MS質(zhì)譜圖Figure 3 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype TT of rs17782313

表2 兩組基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of geneotypes and allele frequencies between the two groups

表3 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for hypertension

3 討論

原發(fā)性高血壓病是多個微效基因遺傳與環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜疾病。超重和肥胖是原發(fā)性高血壓病的獨立危險因素在國內(nèi)外早已形成共識，腰臀比 (WHR)、BMI、腰圍 (WC)可預(yù)測高血壓的發(fā)生風(fēng)險［5］。近來研究表明，遺傳因素在原發(fā)性高血壓病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［6］。超重和肥胖本身引起的代謝紊亂與動脈硬化存在密切關(guān)系，且脂肪組織分泌的脂肪因子如瘦素與高血壓相關(guān)［7－8］，因此與超重和肥胖相關(guān)的基因有可能是引起原發(fā)性高血壓病的候選基因。

MC4R是Willer等［9］研究發(fā)現(xiàn)的與 BMI、肥胖呈強(qiáng)陽性相關(guān)的基因，是能量平衡及飲食攝入的重要調(diào)節(jié)因子。rs17782313位點位于MC4R下游188 kb處18q22上。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓組CC、CT、TT基因型分布與對照組有明顯差異，且高血壓組C等位基因頻率高于對照組;此外，多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因是高血壓的獨立危險因素〔OR(95%CI)=1.444(1.040，2.006)，P=0.028〕，提示rs17782313位點攜帶C等位基因者患高血壓的風(fēng)險是非C等位基因攜帶者的1.444倍。以上說明rs17782313位點多態(tài)性是湖南地區(qū)漢族人群高血壓高發(fā)的重要遺傳危險因素。對于該基因與原發(fā)性高血壓病直接相關(guān)還是通過肥胖再導(dǎo)致高血壓的發(fā)生目前尚無定論。

Timpson等［10］對丹麥白色人種54 244例樣本研究發(fā)現(xiàn)，MC4R rs17782313位點多態(tài)性與BMI相關(guān)，而與高血壓無直接相關(guān)性，每增加10%BMI即可增加3.85 mm Hg SBP和1.79 mm Hg DBP，認(rèn)為rs17782313位點可能通過BMI這個中間表型間接與高血壓有關(guān)。另外，在對我國6～18歲大樣本的研究中也發(fā)現(xiàn)，調(diào)整BMI后rs17782313位點與高血壓發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性消失，提示該位點可能通過BMI間接與高血壓的易患風(fēng)險有關(guān)［3］。與之相反，本研究結(jié)果顯示，rs17782313位點與高血壓發(fā)病直接相關(guān)，有可能是由于選擇的研究對象不同造成與上述研究結(jié)果不一致。有關(guān)學(xué)者傾向于認(rèn)為MC4R與高血壓的發(fā)生有著直接相關(guān)關(guān)系，并就其可能的內(nèi)在病理生理機(jī)制作了研究。Greenfield等［11］從遺傳學(xué)及藥理學(xué)角度說明MC4R與高血壓有關(guān)，并且通過中樞性黑素皮質(zhì)信號通路影響高血壓的發(fā)生，這種作用的實現(xiàn)與肥胖所致的高胰島素血癥無關(guān)。Sohn等［12］認(rèn)為MC4R產(chǎn)物黑素皮質(zhì)素受體－4具有雙向調(diào)節(jié)交感神經(jīng)及副交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元的作用，從而影響胰島素及血壓的變化。

在對我國漢族兒童人群的研究中也發(fā)現(xiàn)rs17782313位點與中心性肥胖相關(guān)［13］。Dwivedi等［14］研究發(fā)現(xiàn)rs17782313位點在兒童及成年人中均與肥胖相關(guān)，但其相關(guān)性隨著年齡的增加而減弱。本研究尚未發(fā)現(xiàn)rs17782313位點與BMI或肥胖存在線性回歸關(guān)系，與以上結(jié)論不一致，但與Vasan等［15］的研究結(jié)果一致。可能與以下因素有關(guān):(1)與研究對象的選擇有關(guān)，本研究的研究對象平均年齡＞60歲，屬于老年人群，隨著年齡的增加，容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、脊柱變形，因此所測身高與體質(zhì)量可能存在一定偏差，從而對以BMI為指標(biāo)界定的肥胖可能造成一定影響;此外，rs17782313位點本身可能與年齡存在相關(guān)性，因為隨著年齡的增加環(huán)境因素可能會掩蓋或減弱微效基因作用［14］。(2)不同地區(qū)、不同人群的背景存在差異性。(3)可能與本研究的樣本量，所選擇的統(tǒng)計學(xué)方法有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，rs17782313位點與TC存在線性回歸關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)與LDL－C相關(guān)，與有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)該位點與TC及LDL－C均相關(guān)不同［16］。Cheung等［17］認(rèn)為 rs17782313 位點與代謝綜合征有相關(guān)性。Wilkinson等［18］發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥患者與對照組相比有更高的中心脈壓及更嚴(yán)重的動脈硬化程度。綜合以上文獻(xiàn)信息，提示rs17782313位點有可能通過血清TC的變化導(dǎo)致動脈硬化、血管重構(gòu)，從而間接引起高血壓。

綜上所述，本研究提示rs17782313位點多態(tài)性與湖南長沙地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓病相關(guān)，從遺傳流行病學(xué)角度認(rèn)為該位點攜帶C等位基因者存在遺傳易患性，但是原發(fā)性高血壓病是多基因遺傳與多環(huán)境因素共同作用的慢性疾病，故高血壓發(fā)病仍存在環(huán)境等因素的作用。由于本研究樣本量較小，結(jié)果可能存在一定的局限性。因此，今后應(yīng)在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上進(jìn)一步針對強(qiáng)微效基因之間或微效基因與環(huán)境因素之間交互作用進(jìn)行研究，以進(jìn)一步明確原發(fā)性高血壓病的發(fā)病機(jī)制。

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