李玉澤，任克，李光，徐克

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽(yáng)110001；2.解放軍第202醫(yī)院放射科，沈陽(yáng)110812；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，沈陽(yáng)110001）

三維適形放射治療解除惡性膽道梗阻療效的實(shí)驗(yàn)研究

李玉澤1，2，任克1，李光3，徐克1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，沈陽(yáng)110001；2.解放軍第202醫(yī)院放射科，沈陽(yáng)110812；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，沈陽(yáng)110001）

目的研究三維適形放射治療（3D CRT）對(duì)兔VX2膽總管移植瘤所致膽道梗阻的療效。方法通過VX2膽總管移植瘤建立膽道梗阻模型。實(shí)驗(yàn)兔被隨機(jī)分為放療組和對(duì)照組。放療組接受放射治療，對(duì)照組單純飼養(yǎng)1周。比較放療前后2組實(shí)驗(yàn)兔膽道擴(kuò)張程度、腫瘤大小及微血管密度（MVD）。結(jié)果放療組和對(duì)照組各納入19只實(shí)驗(yàn)兔，放療1周后放療組腫瘤直徑、膽總管管徑及肝內(nèi)膽管起始部管徑明顯低于放療前（P均＜0.01），且低于對(duì)照組單純飼養(yǎng)1周后（P均＜0.01）。放療組與對(duì)照組MVD計(jì)數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.43，P＜0.01）。結(jié)論3D CRT能夠減輕兔VX2膽總管移植瘤所致的膽道梗阻程度。

三維適形放射治療；惡性膽道梗阻；動(dòng)物模型；兔VX2

膽管癌是膽道常見腫瘤，往往造成膽道不同程度梗阻，其起病隱襲，多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期，失去了根治性切除的機(jī)會(huì)，因此放化療等輔助性治療對(duì)于晚期膽管癌的治療具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究三維適形放射治療（3-Dimensional conformal radiation therapy，3D CRT）對(duì)兔VX2膽總管移植瘤所致膽道梗阻的療效，探討3D CRT對(duì)惡性膽道梗阻的治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 建立兔膽道梗阻模型

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為40只新西蘭大白兔，4～5個(gè)月齡，雌雄不限，體質(zhì)量（2.50±0.50）kg，新西蘭大白兔和VX2瘤鱗癌細(xì)胞株由遼寧省影像診斷與介入治療中心實(shí)驗(yàn)室提供。傳種兔麻醉后（速眠新，長(zhǎng)春畜牧業(yè)大學(xué)）取出VX2腫瘤，剔除壞死組織，選取腫瘤邊緣的魚肉樣組織，制成組織塊懸液。

于兔劍突下沿腹白線正中切口約5 cm找到膽總管，將VX2瘤組織塊懸液通過注射器注入到膽總管下段管壁周圍結(jié)締組織中，手術(shù)2周后，每隔2 d利用雙源CT機(jī)（Siemens Definition）檢測(cè)腫瘤大小及判斷膽道梗阻程度，當(dāng)腫瘤直徑＞1 cm且出現(xiàn)肝內(nèi)膽管擴(kuò)張時(shí)開始實(shí)驗(yàn)研究。腫瘤大小測(cè)量最大切

面的長(zhǎng)徑。

1.2 制定放射治療計(jì)劃

采用盲法隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)兔分為放療組和對(duì)照組。放療組實(shí)驗(yàn)兔采用速眠新（0.2 mL/kg）麻醉后，仰臥固定在CT定位機(jī)（東芝4排CT）固定架上，將放療專用體膜剪成小塊后進(jìn)行水浴，體膜充分水浴后塑形固定于兔子體部，并粘上鉛點(diǎn)，CT定位采用增強(qiáng)掃描以便更好地顯示病灶，掃描結(jié)束后將CT定位數(shù)據(jù)傳送至放療計(jì)劃制定系統(tǒng)，放療計(jì)劃的制定由放療科物理師和醫(yī)師共同完成，采用兩個(gè)傾斜角度對(duì)穿照射進(jìn)行3D CRT，經(jīng)過設(shè)計(jì)，腫瘤中心的照射劑量為17 Gy。放療計(jì)劃制定后，放療組實(shí)驗(yàn)兔利用醫(yī)用電子直線加速器（西門子PRIMUS-M型）行三維適形放射治療。

1.3 組織學(xué)檢查及結(jié)果判定

放療組實(shí)驗(yàn)兔3D CRT后1周，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔單純飼養(yǎng)后1周，將實(shí)驗(yàn)兔處死，腫瘤及其周圍組織、部分肝臟取出后脫水、固定，行HE染色及免疫組化檢查。CD34染色以腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。任何被抗體染成棕褐色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群，不管是否形成管腔，均作為1條可計(jì)數(shù)的微血管。參照Weidner改進(jìn)式方法，先在低倍鏡下（×100）掃視整個(gè)切片，尋找高血管密度區(qū)，然后換高倍鏡（×200）觀察并計(jì)數(shù)，記錄5個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為該例的微血管密度（microvessel density，MVD）。

在CT圖像上分別測(cè)量放療前2組實(shí)驗(yàn)兔、放療1周后放療組實(shí)驗(yàn)兔、單純飼養(yǎng)1周后對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔膽總管直徑、肝內(nèi)膽管起始部直徑，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。放療組放療后與對(duì)照組單純飼養(yǎng)1周后MVD計(jì)數(shù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。放療組、對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔膽總管直徑、肝內(nèi)膽管起始部直徑和腫瘤大小的組內(nèi)、組間比較均采用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔VX2膽總管移植瘤生長(zhǎng)情況

40只實(shí)驗(yàn)兔中由于術(shù)前麻醉劑過量死亡1只，術(shù)后由于腹腔感染死亡1只，最后納入本研究的實(shí)驗(yàn)兔共38只。放療組和對(duì)照組各19只。

放療前放療組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤大小為（1.88±0.89） cm，對(duì)照組為（1.75±0.94）cm。放療組實(shí)驗(yàn)兔放療1周后腫瘤大小為（1.26±0.25）cm，與放療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.92，P＜0.01）。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔單純飼養(yǎng)1周后腫瘤大小為（2.86±1.65）cm，對(duì)比1周前腫瘤增大（t=2.55，P＜0.05）。2組實(shí)驗(yàn)兔接受治療前腫瘤大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.44，P＞0.05），放療組實(shí)驗(yàn)兔放療后1周腫瘤直徑明顯小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.18，P＜0.01）。

2.2 CD34抗體免疫組化染色結(jié)果

CD34抗體的免疫組化染色在所有實(shí)驗(yàn)兔的腫瘤中均呈陽(yáng)性表達(dá)。見圖1。

放療組放療1周后所測(cè)得MVD計(jì)數(shù)為34.26± 3.35，對(duì)照組在單純飼養(yǎng)1周后所測(cè)得MVD計(jì)數(shù)為48.41±4.23，2組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=11.43，P＜0.01）。

Fig.1 CD34 staining in radiotherapy group and control group× 200圖1放療組與對(duì)照組CD34染色比較×200

2.3 肝內(nèi)外膽管擴(kuò)張程度測(cè)量結(jié)果

2組實(shí)驗(yàn)兔均出現(xiàn)肝內(nèi)外膽管擴(kuò)張，膽囊增大，即成功建立了膽道梗阻模型。周圍肝臟和淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。放療后膽道梗阻程度明顯減輕。見圖2、3。

放療組放療前實(shí)驗(yàn)兔膽總管與肝內(nèi)膽管起始部平均管徑為（13.5±1.46）mm，對(duì)照組為（12.9± 2.14）mm，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.01，P＞0.05）。3D CRT 1周后放療組實(shí)驗(yàn)兔平均管徑為（10.8±

2.31）mm，擴(kuò)張程度減輕，與1周前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.31，P＜0.01），亦明顯低于對(duì)照組單純飼養(yǎng)1周后［（15.8±2.26）mm，t=6.74，P＜0.01］。對(duì)照組單純飼養(yǎng)1周后膽道擴(kuò)張程度增加，與1周前的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.06，P＜0.01）。

圖3 放療組實(shí)驗(yàn)兔放療前CT圖像，肝內(nèi)外膽管明顯擴(kuò)張F(tuán)ig.3 CT showed the notable extension of intrahepatic and extrahepatic bile ducts of experimental rabbits in treated group before radiotherapy

圖4 放療組實(shí)驗(yàn)兔放療后1周CT圖像，肝內(nèi)外膽管擴(kuò)張程度明顯減輕Fig.4 The extension of intrahepatic and extrahepatic bile ducts of experimental rabbits in treated group was significant released one week after radiotherapy

3 討論

惡性膽道梗阻的病因中以膽管癌為最常見。膽管癌發(fā)病率逐年增加，惡性程度高，缺乏有效的治療方法，外科手術(shù)切除病灶是目前唯一的根治性治療方法［1］，但文獻(xiàn)報(bào)道患者手術(shù)后5年生存率低于11%［2］。大多數(shù)膽管癌患者就診時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重的膽道梗阻，已經(jīng)不適合采取手術(shù)切除，此時(shí)3D CRT不失為一種行之有效的解除膽道梗阻的方法［3］。

3D CRT可引起腫瘤內(nèi)微循環(huán)的改變，腫瘤血管內(nèi)血栓形成導(dǎo)致血管腔狹窄或閉塞，腫瘤供血減少，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。射線能夠引起癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性改變，直接或間接地?fù)p傷腫瘤細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而殺滅腫瘤細(xì)胞［4，5］。

由于惡性腫瘤往往呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則，因而傳統(tǒng)的放療為了不遺漏病灶往往擴(kuò)大照射范圍，造成周圍較多的正常組織和器官受到不必要的照射，增加了不良反應(yīng)和放射損傷；有時(shí)為了避免損傷周圍的重要器官，降低了照射劑量，使腫瘤無(wú)法完全殺滅，為腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)埋下隱患。

3D CRT是一項(xiàng)能使放療高劑量射線在三維立體方向與腫瘤靶區(qū)的形狀完全一致的全新放療技術(shù)，能夠做到精確定位、精確治療和精確照射，能夠提高膽管癌瘤區(qū)的照射劑量，明顯減輕周圍正常組織的照射損傷，使腫瘤縮小，進(jìn)而緩解膽道梗阻程度。

目前MVD測(cè)定已成為評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”。腫瘤的新生血管形成與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，MVD能準(zhǔn)確可靠反映腫瘤血管生成。

兔VX2腫瘤應(yīng)用范圍廣泛，常用于建立動(dòng)物模型、影像學(xué)研究，惡性腫瘤介入、射頻治療研究［6～8］等方面?？山臃N到兔的各個(gè)臟器，常見的有肝臟［9］、胃［10］、肺［11］、腎臟［12］、直腸［13］等部位建立動(dòng)物模型。膽管癌動(dòng)物模型的建立方法主要為誘發(fā)模型和移植模型，移植瘤模型主要是通過異位移植的方式建立，取新鮮的膽管癌組織或細(xì)胞系移植到皮下或肝臟、腎臟等器官［14～16］。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的膽道梗阻動(dòng)物模型大多是通過開腹手術(shù)或腹腔鏡下結(jié)扎膽總管建立的［17～19］，此類模型不適用于膽道腫瘤的相關(guān)研究和梗阻性黃疸的治療研究。本研究將兔VX2瘤移植到膽總管，隨著腫瘤的生長(zhǎng)壓迫和浸潤(rùn)造成膽道梗阻，比結(jié)扎法建立的模型應(yīng)用范圍更廣，可研究如何通過手術(shù)、放化療、支架置入等方法減輕膽道梗阻程度，也可對(duì)上訴方法的療效進(jìn)行評(píng)估。膽道誘發(fā)腫瘤模型建立困難，移植瘤建立方便、快速，這個(gè)模型的優(yōu)點(diǎn)是膽道腫瘤為原位移植，接近于人體的在體狀態(tài)，也可模擬膽管周圍轉(zhuǎn)移瘤造成的膽道梗阻。通過膽道移植瘤建立的膽道梗阻模型成功率較高，而且兔為中等體型動(dòng)物，能夠耐受手術(shù)、放化療等治療，因此更有利于臨床對(duì)惡性膽道梗阻治療方法改進(jìn)、療效評(píng)估等相關(guān)方面的研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，3D CRT治療后兔肝內(nèi)外膽管的擴(kuò)張程度明顯減輕，因此放療可以解除膽總管移植瘤所致的膽道梗阻。雖然兔VX2膽總管移植瘤并非真正的膽管癌，與人類原發(fā)性膽管癌有一定差異，

其放療療效不能完全代表原發(fā)膽道腫瘤的放療療效，但是能夠模擬膽管癌或者膽管周圍轉(zhuǎn)移瘤侵犯膽道及壓迫膽道等造成膽道梗阻，對(duì)于膽道梗阻的研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)于膽管癌或轉(zhuǎn)移瘤造成的惡性膽道梗阻，放療可以使腫瘤縮小，可以有效減輕膽道梗阻程度。

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（編輯武玉欣）

ExperimentalStudy of3DCRTEffecton MalignantBiliary Obstruction

LIYu-ze1，2，REN Ke1，LIGuang3，XUKe1
（1.Department of Radiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Radiology，202 Hospital of China PLA，Shenyang 110812，China；3.DepartmentofRadiotherapy，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the 3D CRT effect on rabbit biliary obstruction through transplantation of VX2 tumor into rabbit common bile duct.MethodsRabbit biliary obstruction models were built through transplantation of VX2 tumor into rabbit common bile duct，and then were divided into the treated group and the control group randomly.Rabbits in the treated group were treated with radiotherapy，while rabbits in the control group were fed only.The first and the second biliary expansion extents，tumor sizes and MVD were compared and analyzed between the treated and control groups.ResultsThere were 19 experimental rabbits in the treated and control groups，respectively.One week after radiotherapy，tumor size，common bile duct diameter and the start diameter of intrahepatic bile duct of the rabbits in the treated group obviously decreased compared to those before radiotherapy（P＜0.01），which were significantly lower than those in control group（P＜0.01）.There were statistical differences of MVD in the two groups（t=11.43，P＜0.01）.ConclusionRadiotherapy can reduce the degree ofbiliary obstruction caused by rabbitcommon bile ductVX2 tumor.

3-dimensional conformal radiation therapy；malignant biliary obstruction；animal models；rabbit VX2

R815.6

A

0258-4646（2014）01-0071-04

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2012225013）

李玉澤（1976-），男，主治醫(yī)師，碩士.

任克，E-mail：renke815@sina.com

2013-11-15

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