（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖中心，沈陽110004）

體外受精—胚胎移植中不同授精濃度對胚胎質量及妊娠結局的影響

楊大磊，潘伯臣，何麗霞，王秀霞，王天任，李正濤

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖中心，沈陽110004）

目的通過比較不同授精濃度下胚胎發(fā)育及妊娠結局，探討體外受精—胚胎移植（IVF-ET）中較為合適的授精濃度。方法對因輸卵管因素接受IVF-ET的夫婦進行隨機對照試驗，根據(jù)不同授精濃度隨機分為3組：A組為（0.1～0.5）×106/mL，B組為（0.5～1.0）×106/mL，C組為（1.0～1.5）×106/mL。比較3組間正常受精率、多精受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率、著床率及流產(chǎn)率。結果3組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率及流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但B組和C組的多精受精率（分別為14.9%和13.2%）明顯高于A組（8.6%）（P＜0.05），而且C組的妊娠率及種植率（50.0%，29.5%）明顯高于B組（41.4%，20.4%）和A組（38.6%，18.8%）（P＜0.05）。結論IVF-ET治療中，增加授精滴中精子濃度可導致卵子多精受精增加，但在一定范圍內增加精子濃度可能改善妊娠結局。

體外受精—胚胎移植；精子濃度；授精；多精受精；妊娠率

1978年世界首例試管嬰兒誕生以來人類輔助生殖技術發(fā)展近35年，獲得滿意的體外受精—胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療結局是所有學者所共同追求的目標。很多因素可以影響IVF-ET的治療結局，如患者本身的生理條件、臨床用藥方案、實驗室技術及設備等等。其中精子—卵子體外共同孵育即授精是IVF-ET治療過程重要環(huán)節(jié)之一，得到了國內外學者的關注。授精時的精子濃度有可能影響胚胎的發(fā)育及妊娠的結局。本文旨在通過前瞻性分析不同精子濃度對受精、胚胎發(fā)育及妊娠結局的影響，來探討IVF-ET治療過程中授精時合適的授精濃度。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012年1月至2012年6月在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院輔助生殖中心因輸卵管梗阻因素不孕行常規(guī)IVF-ET治療的患者，共210例?；颊咂骄挲g（31.9±5.2）歲，不孕年限（4.3±2.8）年，平均取卵數(shù)（9.3±5.7）個，共獲卵1 957枚。男方精液檢驗指標均在正常范圍。

1.2方法

1.2.1 臨床治療：所有患者均接受常規(guī)的IVF-ET治療。女方采用常規(guī)超促排卵方案，人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）注射后36 h在B超引導下經(jīng)陰道取卵，卵子經(jīng)孵育2～4 h后進行授精。

1.2.2 授精：將充分液化的精液采用梯度離心加上游法進行處理，并吸取上層的精子懸液在Quinn′s 1020培養(yǎng)液中進行稀釋調節(jié)。授精采用微滴法，卵裂期及移植用培養(yǎng)液分別為Quinn′s 1026及Quinn′s 1029，Thermo單氣培養(yǎng)箱，5%CO2。微滴為100 μL，平均每滴放置2枚卵子，16～18 h后觀察受精情況。

1.2.3 分組：授精液用Makler精子計數(shù)板進行計數(shù)［1］。取少許授精液，65℃水浴滅活5 min，然后計數(shù)100個小方格，計數(shù)總數(shù)×105/mL即為精子的密度。將患者隨機分A、B、C 3組。A組體外授精時，調整精子授精濃度為（0.1～0.5）×106/mL，即每滴授精液中含1萬～5萬條精子；B組精子授精濃度為（0.5～1.0）×106/mL，即每滴授精液中含5萬～10萬條精子；C組精子授精濃度為（1.0～1.5）×106/mL，即每滴授精液中含10萬～15萬條精子。每組均為70例患者（周期），獲卵數(shù)分別為653枚、656枚、648枚。

1.2.4 胚胎評分：采用ASEBIR評分系統(tǒng)［2］，D3胚胎，7～8個細胞且大小均勻、碎片＜10%、無液泡、透明帶正常者為優(yōu)質胚胎。

1.2.5 妊娠結局：移植后14 d，測血HCG值陽性且35 d后B超觀察到宮腔內胎囊及胎心，則確認臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 患者臨床特征的組間比較

3組患者之間女方年齡、不孕年限、平均移植胚胎數(shù)及男方的精液參數(shù)包括精子密度、精子活動率及精子正常形態(tài)百分率均無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 患者臨床特征的組間比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics among the three groups

2.2 患者IVF-ET治療結局的組間比較

A、B和C組之間在受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率及流產(chǎn)率均無顯著差異（P＞0.05），但多精受精率、臨床妊娠率和著床率的差異顯著。其中B、C兩組多精受精率明顯高于A組（P＜0.05），但B、C兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C組妊娠率明顯高于A組和B組（P＜0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。C組胚胎著床率明顯高于A組和B組（P＜0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 IVF?ET治療的實驗室及臨床結局Tab.2 Laboratory and clinical outcomes of IVF?ET treatment

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，卵子長時間與高濃度的精子在微滴中共同孵育時，精子產(chǎn)生的水解酶和自由基可對卵子造成損害［3，4］，而縮短精卵共同孵育時間可以改善胚胎發(fā)育及提高妊娠率［5］，高濃度精子可以導致

多精受精的發(fā)生［6，7］。這些結果提示，如果授精液中精子數(shù)量過多，其代謝產(chǎn)物會對卵子、胚胎乃至妊娠結局產(chǎn)生較大影響，因此有學者提出應盡可能降低授精液中的精子濃度及作用時間。但也有學者提出相反的觀點，認為精子濃度與多精受精無相關性［8］，而且縮短精子對卵子的作用時間非但不能改善胚胎的形態(tài)及妊娠的結局，反而可以降低正常受精率［9］?？梢?，有關體外授時適宜的精子濃度和作用時間等問題尚存爭議。最近，有學者用山羊配子做研究，將孵育時間（范圍2～28 h）與精子濃度［（0.5～4）×106/mL］綜合分析，提出在孵育時間為12～14 h、精子濃度4×106/mL時可達到最佳的穿透能力及得到優(yōu)質的胚胎。此外，該實驗還考慮了精子的其他參數(shù)和卵丘卵母細胞復合體等可能的影響因素［10］。也就是說，決定授精效果的因素很多，包括精子的濃度和精卵作用時間，甚至還包括授精滴的體積、動物物種和其他培養(yǎng)條件。因此，在評價體外授精效果時，應該結合具體的實驗條件或排除干擾因素后進行分析探討。

本研究采用過夜培養(yǎng)的方法，在固定精卵孵育時間的條件下著重分析人類輔助生殖技術IVF-ET過程中不同授精濃度對胚胎發(fā)展及妊娠結局的影響。為了排除患者自身病情因素對實驗室和臨床妊娠結局可能帶來的影響，我們選擇單純輸卵管性不孕的女性患者，同時選擇精液常規(guī)分析精子各項參數(shù)均在正常范圍的男性。而且隨機分組后，3組之間除授精精子濃度外，女方年齡、不孕年限、平均取卵數(shù)、平均移植數(shù)和男方精子常規(guī)分析參數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），具有可比性。結果顯示，3組間的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質胚胎率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），說明在精子濃度達到一定程度后，在此范圍內增加或降低精子的濃度并不會影響精子的正常受精率和卵裂率，也不會影響胚胎的形態(tài)。但是，隨著授精精子濃度的增加，多精受精率明顯增高，C組多精受精率已接近A組的1倍，且精子濃度與多精受精率之間存在量效關系，提示增加精子的濃度可能會導致異常受精率的增加，與上述部分研究的結果一致［6，7］。然而從臨床結局看，3組之間雖然流產(chǎn)率沒有顯著性差異（P＞0.05），但C組的妊娠率和著床率卻明顯高于A、B兩組（P＜0.05）。而且精子濃度與妊娠率和著床率之間存在量效關系，說明在一定范圍內增加精子濃度有可能改善妊娠結局。我們的結果與之前的研究結果［11］不一致的可能原因是因為我們設計的最高授精濃度為15萬/滴（相當于1.5×106/mL，精/卵比例75 000∶1），此濃度下精子產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物仍不足以影響胚胎的發(fā)展，而一定程度上高濃度的精子反而給予卵子更多的選擇與質量優(yōu)良的精子結合，產(chǎn)生更優(yōu)質的胚胎（盡管在光學顯微鏡下從形態(tài)上無法觀察到），因而產(chǎn)生更好的臨床結局。雖然在自然受孕的過程中真正到達卵子周圍的精子僅有數(shù)十條，但那是在女性生殖道中通過層層的生理屏障優(yōu)選出的最優(yōu)質的精子。而在體外授精過程中，我們無法模擬更多的生理優(yōu)選精子的方式，只能通過適當提高精子的濃度，讓精卵自然選擇，優(yōu)勝劣汰。此時，提高精子濃度也就意味著更多產(chǎn)生優(yōu)質胚胎的機會。人們普遍擔心培養(yǎng)液中精子數(shù)量較多時其產(chǎn)生的活性氧會對卵子造成傷害，但近期的研究表明，適量的活性氧對精子的獲能、活化和頂體反應是必須的［12］。因此，應該尋找和維持授精液中適當?shù)木訚舛?，而不是精子濃度越低越好。本研究中高濃度精子組臨床結局較好的原因或許與此有關。

總之，本研究既證實了培養(yǎng)體系中多精受精率隨精子濃度增高而增高，也發(fā)現(xiàn)了高精子濃度組臨床結局較好的現(xiàn)象。如何權衡好本研究結果帶來的利與弊，做出更合理的選擇，是我們今后應該考慮的問題。同時需要指出，迄今為止有關人卵體外受精中最適精子濃度的專門研究報道較少，尚無統(tǒng)一規(guī)范。國外文獻顯示，較常使用的精子濃度為0.15×106/mL左右［13］，但也有高達（4～10）×106/mL［5］，本研究設計精子濃度在此之間。本研究是在我院生殖中心實驗條件下的初步探索，其意義在于揭示一種有別于先前觀點的實驗現(xiàn)象，而不在于推廣某種實驗方法，因為各生殖中心的實驗條件各異。同時，本研究結果與結論仍待今后更大樣本量的實驗研究證實。

［1］徐建平，黃宇烽，商學軍，等.Makler精子計算盤的應用及其臨床意義［J］.臨床檢驗雜志，1995，13（5）：243-244.

［2］Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment：proceedings of an expert meeting［J］.Hum Reprod，2011，26（6）：1270-1283.

［3］Rehman N，Collins AR，Suh TK，et al.Effect of sperm exposure time on in vitro fertilization and embryo development of bovine oocytes matured in vitro［J］.Theriogenology，1994，41（7）：1447-1452.

［4］Aitken JR.A free radical theory of male infertility［J］.Reprod Fertil，1994，6（1）：19-24.

［5］Dirnfeld M，Bider D，Koifman M，et al.Shortened exposure of oocytes to spermatozoa improves in-vitro fertilization outcome：a prospective，randomized，controlled study［J］.Hum Reprod，1999，14（10）：2562-2564.

［6］Wolf DP，Byrd W，Dandekar P，et al.Sperm concentration and the fertilization of human eggs in vitro［J］.Biol Reprod，1984，31（4）：837-848.

［7］Nagai T，Niwa K，Iritani A.Effect of sperm concentration during preincubation in a defined medium on fertilization in vitro of pig follicular oocytes［J］.J Reprod Ferti，1984，70（1）：271-275.

［8］Uhler ML，Buyalos RP.The effect of varying inseminating sperm concentration in male factor and non-male factor infertility during in vitro fertilization［J］.Int J Fertil Menopausal Stud，1995，40（6）：322-328.

［9］Lundqvist M，Johansson U，Lundkvist O，et al.Reducing the time of co-incubation of gametes in human in-vitro fertilization has no beneficial effects［J］.Reprod Biomed Online，2001，3（1）：21-24.

［10］Palomo M，Mogas T，Izquierdo D，et al.The influence of sperm concentration，length of the gamete co-culture and the evolution of different sperm parameters on the in vitro fertilization of prepubertal goat oocytes［J］.Zygote，2010，18（4）：345-355.

［11］黃國寧，孫海翔.體外授精—胚胎移植實驗室技術［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：168-169.

［12］De Lamirande E，O'Flaherty C.Sperm activation：role of reactive oxygen species and kinases［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1784（1）：106-115.

［13］Barraud-Lange V，Sifer C，Pocaté K，et al.Short gamete co-incubation during in vitro fertilization decreases the fertilization rate and does not improve embryo quality：a prospective auto controlled study［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25（7）：305-310.

（編輯陳姜）

EffectofDifferentSperm Insemination Concentrationson Embryo Quality and Pregnancy Outcome in IVF-ET

YANG Da-lei，PANBo-chen，HE Li-xia，WANGXiu-xia，WANGTian-ren，LIZheng-tao
（CenterforAssisted Reproduction，DepartmentofObstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the optimal sperm insemination concentration for the in vitro fertilization-embryo transfer（IVF-ET）procedure through comparison of the outcomes of IVF-ET with different sperm insemination concentrations.MethodsA randomized controlled trial was carried out in 210 couples who received IVF-ET treatment for tubal factor infertility.Couples were randomly divided into three groups according to the insemination concentrations：group A with concentration（0.1-0.5）×106/mL，group B（0.5-1.0）×106/mL，and group C（1.0-1.5）×106/mL.Normal fertilization rate，polyspermy rate，cleavage rate，high-quality embryo rate，pregnancy rate，implantation rate and abortion rate were compared between the three groups.ResultsNo significantdifference wasfound in normalfertilization rate，cleavage rate，high-quality embryo rate and abortion rate between the three groups（P＞0.05）.However，the polyspermy rates of group B（14.9%）and group C（13.2%）were significantly higher than that of group A（8.6%）（P＜0.05）.In addition，the pregnancy rate（50.0%）and implantation rate（29.5%）of group C were significantly higher than those ofgroup B（41.4%and 20.4%）and group A（38.6%and 18.8%），respectively（P＜0.05）.ConclusionIncreasing the sperm concentration ofinsemination in the culture dropletin IVF-ET treatmentmay increase the risk ofpolyspermy fertilization.However，increasing the sperm insemination concentration within a certain scope may improve the treatmentoutcome.

in vitro fertilization-embryo transfer；sperm concentration；insemination；polyspermy；pregnancy rate

R321-33

A

0258-4646（2014）01-0067-04

遼寧省教育廳高校科研計劃（LT2010106）

楊大磊（1981-），男，技師，本科.

潘伯臣，E-mail：panpancmu@yahoo.com.cn

2013-11-20

網(wǎng)絡出版時間：