（沈陽(yáng)體育學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110102）

水迷宮訓(xùn)練對(duì)抑郁大鼠齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

吳翊馨，蘇勝林

（沈陽(yáng)體育學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110102）

目的研究抑郁癥學(xué)習(xí)記憶障礙與齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的關(guān)系。方法20只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和抑郁癥模型組（模型組）。復(fù)制慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激模型。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)變化，Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，電鏡觀察大鼠海馬結(jié)構(gòu)及其微小血管形態(tài)學(xué)變化，免疫組化技術(shù)檢測(cè)Nestin及VEGF表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠的行為學(xué)水平和垂直活動(dòng)得分顯著降低；定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏時(shí)和游泳距離顯著延長(zhǎng)；海馬微小血管口徑變大，管壁變厚，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則；Nestin免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和VEGF表達(dá)均明顯低于對(duì)照組。結(jié)論抑郁癥學(xué)習(xí)記憶障礙與慢性應(yīng)激導(dǎo)致的海馬微小血管損傷、海馬齒狀回神經(jīng)再生抑制有關(guān)。

抑郁癥；學(xué)習(xí)記憶；神經(jīng)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；水迷宮

學(xué)習(xí)記憶障礙是抑郁癥的常見(jiàn)癥狀，嚴(yán)重影響患者的工作和生活，特別是對(duì)于青少年影響巨大，但相關(guān)研究較少。海馬是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵部位，與空間學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。目前認(rèn)為海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）存在神經(jīng)再生現(xiàn)象，可能參與了學(xué)習(xí)記憶過(guò)程，如水迷宮訓(xùn)練、跑步及豐富外環(huán)境等因素能夠促進(jìn)DG神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的增殖［1～3］。由于這種增殖主要發(fā)生于海馬微小血管附近，因此推測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能夠促進(jìn)DG神經(jīng)再生，并參與學(xué)習(xí)記憶。在抑郁狀態(tài)下，DG神經(jīng)再生與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子間的關(guān)系目前研究還不多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬抑郁癥的發(fā)生過(guò)程，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，從NSCs增殖和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)等方面，分析其發(fā)生機(jī)制，從而為防治抑郁癥學(xué)習(xí)記憶障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

雌性Wistar大鼠（由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中

心提供），200～220 g，室溫20℃～25℃，濕度40%～50%，光照時(shí)間12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始水迷宮訓(xùn)練，之后采用定位航行實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)篩選出能力相近的20只大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和抑郁癥模型組（模型組）。

1.2 抑郁癥模型建立方法

對(duì)照組不建模，模型組按下述方法建模：在21 d接受各種未預(yù)知刺激，包括禁食24 h，禁水24 h，束縛1 h，夾尾1 min，4℃冷水游泳5 min，45℃烘箱熱烘5 min，電擊足底（共7種刺激），21 d內(nèi)每日隨機(jī)給予1種，電壓為30 V，點(diǎn)擊5 s，間歇5 s，共進(jìn)行2 min，每種刺激在實(shí)驗(yàn)全程中施加3次。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)箱為一個(gè)長(zhǎng)、寬各1 m、高0.5 m的箱體，數(shù)碼攝影機(jī)自動(dòng)記錄3 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。檢測(cè)時(shí)將大鼠放于中央格內(nèi)，以四爪均進(jìn)入的方格數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分，以前肢抬起次數(shù)為垂直活動(dòng)得分。徹底清潔檢測(cè)箱后，檢測(cè)下1只。

1.4 水迷宮訓(xùn)練及評(píng)價(jià)

采用Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)方法［4］水池中加牛奶至不透明，水溫為（22.4±1.6）℃，休息平臺(tái)放在第二象限，位于水面下1 cm，水池外放一固定參照物。訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行5 d，4次/d，于每日上午進(jìn)行。訓(xùn)練時(shí)，將模型組大鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄其找到平臺(tái)所用時(shí)間，即逃避潛伏期，若60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則記為60 s。如大鼠不能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，則將其放置于平臺(tái)上20 s，以強(qiáng)化記憶。在建模過(guò)程中，每天均進(jìn)行1次水迷宮訓(xùn)練。

1.5 巢蛋白（Nestin）免疫組化染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.4 mL/100 g）麻醉后，升主動(dòng)脈注射生理鹽水沖去血液，取雙側(cè)海馬，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液沉底后，連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚25 μm，每隔3張取1張制成1套切片，按說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)操作［5］，染色對(duì)照用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，每例動(dòng)物選取含DG的切片3張，光鏡（10×40）下計(jì)算Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 VEGF免疫組化反應(yīng)

大鼠海馬用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，每隔3張取1張制成1套切片，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，陰性對(duì)照為PBS。每例動(dòng)物選取含DG的3張切片，利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，分析計(jì)算VEGF平均灰度值。

1.7 DG血管的超微結(jié)構(gòu)觀察

4℃下取海馬，切成大小為1 mm3的小塊3～4塊，立即投入2.5%戊二醛（由0.1 mol/L PBS配制，pH7.4）中前固定2 h以上；PBS漂洗液漂洗后，1%鋨酸后固定1 h；乙醇、丙酮梯度脫水；環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透過(guò)夜，包埋，40℃、60℃各24 h常規(guī)聚合；LDBV超薄切片機(jī)切片，厚度約500～600 ?，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，JEM-100CXII型透射電鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，主要采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)表現(xiàn)

對(duì)照組大鼠進(jìn)入檢測(cè)箱后，均迅速離開(kāi)中心區(qū)域，在箱體的周邊和四角活動(dòng)；而模型組大鼠在中心區(qū)域停留時(shí)間較長(zhǎng)，在周邊和四角活動(dòng)較少，其水平和垂直活動(dòng)得分均顯著低于對(duì)照組（表1）。

2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化

對(duì)照組大鼠入水后，多數(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，而模型組大鼠則大多沿桶壁搜索，其找到平臺(tái)所用的游泳距離和時(shí)間均明顯高于對(duì)照組（圖1、圖2、表1）。

表1 大鼠行為學(xué)得分及學(xué)習(xí)記憶變化（x±s，n=10）Tab.1 The behavior scores and learning and memory changes of rats（

表1 大鼠行為學(xué)得分及學(xué)習(xí)記憶變化（x±s，n=10）Tab.1 The behavior scores and learning and memory changes of rats（

Compared to control，1）P＜0.05，2）P＜0.01.

?

圖1 對(duì)照組大鼠典型游泳軌跡Fig.1 The typical swimming trace of a control rat

圖2 模型組大鼠典型游泳軌跡Fig.2 The typical swimming trace of a rat in the model group

2.3 大鼠DGNSCs增殖情況

對(duì)照組陽(yáng)性反應(yīng)物較多，邊緣清楚，而模型組較少，邊緣不清（圖3、圖4）。對(duì)照組Nestin陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)為（18.8±4.5）個(gè)，模型組為（12.4±3.3）個(gè)，數(shù)量明顯減少（n=10，P＜0.01）。此外，電鏡下，對(duì)照組可見(jiàn)到較多的新生神經(jīng)纖維，而模型組則較少（圖5、圖6）。

圖3 對(duì)照組Nestin表達(dá)×400Fig.3 Nestin expression in the control group×400

圖4 模型組Nestin表達(dá)×400Fig.4 Nestin expression in the model group×400

圖5 對(duì)照組有髓神經(jīng)纖維形態(tài)×10 000Fig.5 The morphology of myelinated fibers in the control group ×10 000

圖6 模型組有髓神經(jīng)纖維形態(tài)×10 000Fig.6 The morphology of myelinated fibers in the model group ×10 000

2.4 海馬微小血管的超微結(jié)構(gòu)及VEGF表達(dá)

對(duì)照組大鼠海馬血管口徑較小，壁厚，內(nèi)皮細(xì)胞呈卵圓形，而模型組血管口徑較大，管壁變厚，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則（圖7、圖8）。對(duì)照組可見(jiàn)較多的棕黃色顆粒，其灰度值為110.36±22.26，而模型組則較少（圖9、圖10），灰度值為153.45±34.75，表達(dá)下降（n=10，P＜0.05）。

圖7 對(duì)照組海馬血管結(jié)構(gòu)×7 200Fig.7 Hippocampal vascular structure in the control group ×7 200

圖8 模型組海馬血管結(jié)構(gòu)×7 200Fig.8 Hippocampal vascular structure in the model group ×7 200

圖9 對(duì)照組VEGF表達(dá)×400Fig.9 VEGF expression in the control group×400

圖10 模型組VEGF表達(dá)對(duì)照組×400Fig.10 VEGF expression in the model group×400

3 討論

抑郁癥患者常自述記憶力和注意力減退，學(xué)習(xí)或工作能力下降，不能應(yīng)付以往能夠勝任的工作。這種現(xiàn)象對(duì)于青少年來(lái)說(shuō)，影響更大，主要是因?yàn)榍嗌倌赀€處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，其自我調(diào)節(jié)能力明顯弱于成人。如不積極防治，將極大影響其健康成長(zhǎng)，威脅家庭和社會(huì)的和諧與穩(wěn)定。

3.1 抑郁癥模型大鼠行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力的變化

本實(shí)驗(yàn)所采用抑郁癥模型為大鼠的慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激模型，是國(guó)內(nèi)外常用抑郁癥模型。在行為學(xué)方面，實(shí)驗(yàn)觀察到，對(duì)照組大鼠進(jìn)入箱體后，本能地對(duì)其所處的新的環(huán)境進(jìn)行探究，并在趨暗習(xí)性驅(qū)使下，較少經(jīng)過(guò)中心強(qiáng)光區(qū)域，更多的在四周較暗區(qū)域活動(dòng)。而模型組大鼠則不同，其進(jìn)入箱體后，經(jīng)常通過(guò)中心強(qiáng)光區(qū)域，而在四周較暗區(qū)域活動(dòng)明顯減少，而且其水平和垂直得分均明顯下降，提示模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、興趣降低等類人表現(xiàn)。

在空間學(xué)習(xí)記憶方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠多數(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)找到休息平臺(tái)，其游泳距離和時(shí)間均較短。但模型組大鼠進(jìn)入迷宮后，多是沿桶壁環(huán)游，雖然多數(shù)大鼠可以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到休息平臺(tái)，但游泳距離和時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，結(jié)果與相關(guān)研究相似［4，6］。上述結(jié)果說(shuō)明模型組大鼠的空間記憶受到慢性應(yīng)激刺激干擾，出現(xiàn)了記憶障礙。

3.2 抑郁癥模型大鼠記憶障礙與DG神經(jīng)再生的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的海馬損傷極為常見(jiàn)，且其嚴(yán)重程度與病變程度有關(guān)［7，8］?；谒詫m的學(xué)習(xí)記憶屬于海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶，與DG的NSCs增殖關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，海馬DG的亞顆粒細(xì)胞層存在NSCs，能夠增殖分化生成新的神經(jīng)元，并遷移至顆粒細(xì)胞層，與CA3區(qū)神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，這可能與學(xué)習(xí)記憶的形成及更新有關(guān)，且學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，NSCs增殖越明顯［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，對(duì)照組大鼠DG存在NSCs增殖現(xiàn)象，但模型組大鼠的NSCs增殖卻明顯下降，說(shuō)明慢性應(yīng)激刺激抑制了海馬神經(jīng)再生，此結(jié)果與前期研究相近［11］。由于學(xué)習(xí)記憶能力與海馬再生呈正相關(guān)，因此慢性應(yīng)激刺激干擾了大鼠海馬NSCs增殖，從而造成大鼠空間記憶障礙。

本實(shí)驗(yàn)又觀察到另一現(xiàn)象，即在電鏡下，對(duì)照組海馬組織中出現(xiàn)了較多的新生神經(jīng)纖維，而模型組則較少。盡管難以確定這種現(xiàn)象是否發(fā)生于DG區(qū)域，但有理由推測(cè)其發(fā)生部位可能位于DG，因?yàn)槟壳罢J(rèn)為DG是成年哺乳動(dòng)物大腦唯一存在神經(jīng)新生的區(qū)域。盡管這個(gè)現(xiàn)象可能是另一個(gè)神經(jīng)再生的證據(jù)，還需反復(fù)驗(yàn)證。

3.3 抑郁模型大鼠NSCs增殖與VEGF表達(dá)的關(guān)系

海馬神經(jīng)再生需要眾多因素共同參與。研究發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)再生主要發(fā)生在海馬微小血管附近，因此海馬血管形態(tài)及相關(guān)因素可能參與了海馬神經(jīng)再生。本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組海馬血管口徑變大、管壁變厚、內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)異常，表明抑郁狀態(tài)下海馬區(qū)的微小血管出現(xiàn)損傷，這些變化很有可能造成海馬血供異常，從而影響DG神經(jīng)再生。

VEGF源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以通過(guò)促進(jìn)腦血管形成、改善腦血流等途徑，使神經(jīng)元免受低氧、低血糖損傷，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)［12～15］。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁狀態(tài)下，海馬VEGF表達(dá)下降［16］，本實(shí)驗(yàn)也觀察到類似結(jié)果，其原因可能是海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷。由于VEGF還能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)再生，其表達(dá)下降，也是NSCs增殖抑制的原因之一。

綜上所述，本研究觀察到抑郁狀態(tài)下海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)障礙，其原因可能是慢性應(yīng)激損傷了海馬微小血管，抑制了VEGF表達(dá)，影響了海馬神經(jīng)再生。

［1］羅小泉，駱利平，陳海芳，等.Morris水迷宮檢測(cè)大鼠記憶力方法的探討［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，23（10）：44-65.

［2］Mustroph ML，Chen S，Desai SC，et al.Aerobic exercise is the critical variable in an enriched environment that increases hippocampal neurogenesis and water maze learning in male C57BL/6Jmice［J］. Neuroscience，2012，123（219）：62-71.

［3］Hamilton GF，Beechen KE，Goodlett CR，et al.Housing in environmental complexity following wheel running augments survival of newly generated hippocampal neurons in a rat model of binge alcohol exposure during the third trimester equivalent［J］.Alcohol Clin Exp Res，2012，36（7）：1196-204.

［4］單德紅.定志小丸的抗抑郁機(jī)制研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005，6（16）：239-246.

［5］閆醒予，王德山，單德紅，等.定志小丸對(duì)雌性抑郁大鼠雌二醇和齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，12（6）：43-45.

［6］單德紅，柴紀(jì)嚴(yán)，王德山，等.定志小丸對(duì)抑郁模型大鼠齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞和學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，11（8）：1426-1427.

［7］HattiangadyB，Shetty AK.Neural stem cell grafting counteracts hippocampal injury-mediated impairments in mood memory and neurogenesis［J］.Stem Cells Transl Med，2012，1（9）：696-708.

［8］Sala M，Perez J，Soloff P，et al.Stress and hippocampal abnormalities in psychiatric disorders［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2004，14（5）：393-405.

［9］Feng R，Rampon C，Tang YP，et al.Deficient neurogenesis in forebrain-specific presenilin-1 knockout mice is associated with reduced clearance of hippocampal memory traces［J］.Neuron，2001，21（32）：911-926.

［10］Kempermann G，Gage FH.Experience-dependent regulation of adult hippocampal neurogenesis：Effects of long-term stimulation and stimulus withdrawal［J］.Hippocampus，1999（9）：321-332.

［11］柴紀(jì)嚴(yán)，單德紅，王德山，等.定志小丸對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞Nestin表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，23（4）：29-30.

［12］Tsai YW，Yang YR，Sun SH et al.Post ischemia intermittent hypoxia induces hippocampal neurogenesis and synaptic alterations and alleviates long-term memory impairment［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（5）：764-73.

［13］Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin Invest，2000，106（7）：829-838.

［14］Thau-Zuchman O，Shohami E，Alexandrovich AG，et al.Subacute treatment with vascular endothelial growth factor after traumatic brain injury increases angiogenesis and gliogenesis［J］.Neuroscience，2012，202（27）：334-341.

［15］封敏，盧圣鋒，張承舜，等.國(guó)內(nèi)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)現(xiàn)狀與分析［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，（11）：484-495.

［16］高良才，王玉婷，勞勛，等.抑郁癥模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化研究［J］.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2009，（1）：355-367.

（編輯裘孝琦）

EffectsofWater Maze Training on Neural-stem-cellProliferation of Dentate Gyrusand Expression of Vascular EndothelialGrowth Factor in Depression ModelRats

WU Yi-xin，SUSheng-lin
（Physiology Teaching and Research Section，Shenyang SportUniversity，Shenyang 110102，China）

ObjectiveTo study the relationship between learning and memory disorderofdepression and neural-stem-cellproliferation and expression ofvascularendothelialgrowth factor（VEGF）.MethodsAtotalof20 female Wistarrats were randomly divided into controlgroup and depression model group（model group）.A chronic unpredicted stress model was established.The open field method was used to assess behavioral scores of rats.The Morris water maze navigation experiment was adopted to evaluate the learning and memory ability of rats.An electron microscope was used to observe the morphological change of hippocampal structure and its vessels.Immunohistochemistry was used to detect expressions of Nestin and VEGFin hippocampalneurons.ResultsCompared with those in control，in the modelgroup，horizontaland verticalscoreswere reduced markedly，and escape latency and swimming distance in the Morris water maze navigation experiment were increased significantly，and hippocampal microvascular structure changed，e.g.the diameter was enlarged，vessel wall was thick，the structures of endothelial cells were irregular，and also，both Nestin immunoreactive cells and VEGF expression were decreased evidently.ConclusionLearning and memory disorder of depression was relative to the hippocampalmicrovasculardamage and neurogenesisinhibition in detate gyrus caused by chronic stress.

depression；learning and memory；neural stem cells；vascular endothelial growth factor；water maze

R34

A

0258-4646（2014）01-0059-05

吳翊馨（1973-），女，副教授，博士研究生. E-mail：yixin0414@163.com

2013-10-28

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