翁 霞，姜顯光

（鞍山師范學院化學與生命科學學院，遼寧鞍山114007）

雙水相萃取分離蘋果皮中果膠酶的研究

翁 霞，姜顯光

（鞍山師范學院化學與生命科學學院，遼寧鞍山114007）

以蘋果皮作為提取果膠酶的原材料，采用PEG/Na2HPO4雙水相系統(tǒng)對果膠酶進行萃取分離，研究了PEG1000濃度、Na2HPO4濃度、pH、NaCl濃度等因素對果膠酶分配系數(shù)的影響。結果表明：雙水相體系質量組成為PEG1000 26%、Na2HPO417%、NaCl 0.004%，pH為4.0時，果膠酶的萃取效率較好，實驗中分配系數(shù)最高可達為13.8954。

雙水相，果膠酶，蘋果皮，酶活力

果膠酶（pectinases）是世界四大酶制劑之一，通常所說的果膠酶是指分解果膠的多種酶的總稱，在食品加工、飼料加工、造紙、環(huán)境保護、廢水處理、誘導植物抗病等方面都有很大的應用價值[1]。目前，雙水相萃取果皮中的果膠酶還沒有報道，報道較多的是PEG和（NH4）2SO4雙水相萃取體系萃取分離果膠酶[2-4]及果膠酶活力測定中酶活力與稀釋倍數(shù)的關系[5]，我國果膠酶的生產(chǎn)技術很不成熟，提取分離中效率低、酶易失活是要重點解決的問題之一。因此，本研究對雙水相技術提取果膠酶進行了初探，以PEG/Na2HPO4雙水相體系為考察對象，比較了不同濃度的PEG1000和Na2HPO4組成的雙水相體系對果膠酶的萃取效果，并考察了影響萃取效果的各種因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果 市售；檸檬酸 分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、聚乙二醇1000（化學純）、考馬斯亮藍G250、牛血清蛋白（生物純）、葡萄糖（分析純）、維生素C（分析純）3，5-二硝基水楊酸（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉 分析純，沈陽化學試劑廠；亞硫酸鈉（分析純）、酒石酸鉀鈉（優(yōu)級純） 天津市光復精細化工研究所。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PL2002型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；80-2B型離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-4型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠酶粗濾液的制備 稱取10g切碎的市售蘋果皮，按1∶1料液比加入pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液后再加入1mL 0.025%維生素C，于研缽中搗碎，在離心機中1200r/min離心10min，于漏斗中過濾，得濾液備用。

1.2.2 PEG/Na2HPO4雙水相體系的建立 取大試管一只，稱重（W0）。準確稱量一定重量的40%PEG1000溶液，加入試管中，計算出加入的PEG1000的量（g）。逐漸加入30%Na2HPO4溶液，混合，直至試管出現(xiàn)渾濁。稱重（W1），計算加入的Na2HPO4（g）。逐滴再加入蒸餾水，振蕩，渾濁的兩相系統(tǒng)“剛剛變澄清”，稱重，計算出系統(tǒng)總質量（W1-W0）。計算系統(tǒng)中PEG1000和Na2HPO4的質量濃度。

1.2.3 雙水相萃取操作方法 參照上述的成相條件，在離心刻度試管中分別加入1mL一定濃度的PEG1000、1mL一定濃度的NaH2PO4、1mL緩沖液、1mL果膠酶粗濾液，再加入蒸餾水使體系達到10g?；靹蚝?000r/min離心10min分離使其分相，分相后測出上下相酶活、蛋白含量，計算比活力、分配系數(shù)K。

1.2.4 牛血清蛋白標準曲線的制作 取牛血清蛋白0.010g溶于適量蒸餾水中，用蒸餾水定容至100mL容量瓶，分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0mL蒸餾水。牛血清蛋白的含量分別為20、40、60、80、100μg，依次加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合。用1cm比色皿，以用1.0mL蒸餾水加5mL考馬斯亮藍G-250溶液做參比溶液，根據(jù)分光光度法快速測定蛋白質的最大吸收波長為640nm，分別測量各溶液的吸光度值，繪制出標準曲線。

1.2.5 蛋白質含量測定方法 采用考馬斯亮藍法[6]。

式中：m2—從標準曲線查得的蛋白質的質量，μg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；m—樣品質量，g。

1.2.6 葡萄糖標準曲線的制作 取葡萄糖0.1g溶于適量蒸餾水中，用蒸餾水定容至100mL容量瓶，取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別加入1.8、1.6、1.4、1.2、1.0mL蒸餾水。葡萄糖的含量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg，依次加入1.5mL DNS溶液，定容在25mL刻度試管中，搖勻，在沸水浴中加熱5min，迅速冷卻。用1cm比色皿，以用2.0mL蒸餾水加1.5mL DNS溶液做參比溶液，根據(jù)分光光度法快速測定葡萄糖的最大吸收波長為490nm，分別測量各溶液的吸光度值，繪制出標準曲線。

1.2.7 果膠酶酶活力測定 采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法[7]。取1mL緩沖液、0.5mL 10g/L葡萄糖溶液，加入0.5mL蘋果皮果膠酶提取液，混勻后在50℃水浴中保溫1h，保溫后迅速加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5min。然后迅速冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻，在波長490nm處測吸光度；依還原糖葡萄糖繪制標準曲線，計算果膠酶酶活性。

式中：m1—從標準曲線查得的葡萄糖質量，mg；V—樣品提取液總體積，mL；Vs—測定時所取樣品提取液體積，mL；t—酶促反應時間，t；m—樣品質量，g；1.08—葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)（=194/180）。

1.2.8 比活力的測定 根據(jù)酶活力測定和蛋白含量測定結果計算果膠酶比活力：

1.3 雙水相萃取分離蘋果皮中果膠酶的單因素實驗

1.3.1 PEG1000濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響 取10g蘋果皮加入10mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1mL 0.025%維生素C（pH=5），搗碎研磨4000r/min離心10min后經(jīng)4層紗布過濾得濾液。在Na2HPO4濃度為19%時，分別以PEG1000濃度為24%、25%、26%、27%、28%構成雙水相萃取蘋果皮粗提液中的果膠酶。測定果膠酶的比活力并計算果膠酶的分配系數(shù)K。

式中：比活力上—上相提取液中果膠酶的比活力；比活力下—下相提取液中果膠酶的比活力。

1.3.2 Na2HPO4濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響 取10g蘋果皮加入10mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1mL 0.025%維生素C（pH=5），搗碎研磨離心后經(jīng)4層紗布過濾得濾液。按1.3.1確定的最佳PEG1000萃取濃度，分別以Na2HPO4濃度為15%、16%、17%、18%、 19%構成雙水相萃取蘋果皮粗提液中的果膠酶。測定果膠酶的比活力并計算果膠酶的分配系數(shù)K。

1.3.3 pH濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響 取10g蘋果皮加入10mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1mL 0.025%維生素C（pH=5），搗碎研磨離心后經(jīng)4層紗布過濾得濾液。按1.3.1確定的最佳PEG1000萃取質量濃度，1.3.2確定的最佳磷酸氫二鈉萃取質量分數(shù)，分別以pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0構成雙水相萃取蘋果皮粗提液中的果膠酶。測定果膠酶的比活力并計算果膠酶的分配系數(shù)K。

1.3.4 NaCl濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響 取10g蘋果皮加入10mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1mL 0.025%維生素C（pH=5），搗碎研磨離心后經(jīng)4層紗布過濾得濾液。按1.3.1確定的最佳PEG1000萃取質量濃度，1.3.2確定的最佳磷酸氫二鈉萃取質量濃度，1.3.3確定的最佳的pH，分別以NaCl濃度為0.0005%、0.0010%、0.0020%、0.0040%、0.0060%構成雙水相萃取蘋果皮粗提液中的果膠酶。測定果膠酶的比活力并計算果膠酶的分配系數(shù)K。

1.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，選取PEG1000濃度、Na2HPO4濃度、pH、NaCl濃度四個因素，采用正交實驗表進行實驗。正交因素水平見表1。

表1 正交因素水平表Table.1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結果與分析

2.1 牛血清蛋白標準曲線制作

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

由圖1可知，牛血清蛋白標準曲線的線性方程為：y=0.0059x-0.0104，相關系數(shù)R2=0.9949。

2.2 葡萄糖標準曲線制作

由圖2可知，葡萄糖標準曲線的線性方程為：y= 0.9637x+0.01026，相關系數(shù)R2=0.9901。

圖2 葡萄糖濃度標準曲線Fig.2 The standard curve of dextrose density

2.3 PEG1000濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響

表2 PEG1000濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響Table.2 Effect of different concentration of PEG1000 on distribution coefficient of pectinase

由表2可知，隨著PEG1000質量濃度的增加，果膠酶分配系數(shù)先增大后減小。在Na2HPO4濃度為19%，PEG1000質量濃度為26.0%時，分配系數(shù)最大。因此，確定PEG1000質量濃度為26.0%時為最佳提取濃度。

2.4 Na2HPO4濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響

表3 Na2HPO4濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響Table.3 Effect of different concentration of Na2HPO4on distribution coefficient of pectinase

由表3可知，隨著Na2HPO4濃度的增加，果膠酶分配系數(shù)先增大后減小。在PEG1000質量濃度為26%，Na2HPO4濃度為17.0%時，分配系數(shù)最大，因此，確定Na2HPO4濃度為17.0%時為最佳提取濃度。

2.5 pH對果膠酶分配系數(shù)的影響

表4 pH對果膠酶分配系數(shù)的影響Table.4 Effect of different pH on distribution coefficient of pectinase

由表4可知，隨著pH的增加，果膠酶分配系數(shù)先增大后減小。在PEG1000質量濃度為26.0%，Na2HPO4濃度為17.0%，pH為5.0時，分配系數(shù)最大，因此，確定pH為5.0時為最佳提取pH。

2.6 NaCl濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響

表5 NaCl濃度對果膠酶分配系數(shù)的影響Table.5 Effect of different concentration of NaCl on distribution coefficient of pectinase

由表5可知，隨著NaCl濃度的增加，果膠酶分配系數(shù)先增大后減小。在PEG1000質量濃度為26.0%，Na2HPO4濃度為17.0%，pH為5.0，NaCl濃度為0.002%時，分配系數(shù)最大，因此，確定NaCl濃度為0.002%時為最佳提取濃度。

表6 正交實驗設計及數(shù)據(jù)處理Table.6 Designing of orthogonal test and data processing

表7 方差分析表Table.7 The variance analysis table

2.7 正交實驗結果分析

由表6可知，各因素影響的主次順序為：D＞C＞B＞A，最優(yōu)組合為：A2B2C1D3。正交實驗確定雙水相萃取體系對蘋果皮中果膠酶活力的影響最佳反應條件為：PEG1000質量濃度為26%，磷酸氫二鈉質量濃度為17%，pH為4.0，氯化鈉質量濃度為0.004%。最優(yōu)組合A2B2C1D3并不在9個正交實驗結果中，對該組合進行驗證實驗得，雙水相萃取體系萃取蘋果皮中果膠酶分配系數(shù)最大可達13.8954。高于表6中其他組合的分配系數(shù)。

由表7可知，D因素影響顯著，A、B、C因素影響不顯著，無顯著性差異。即NaCl的添加量對PEG/Na2HPO4雙水相系統(tǒng)分離果膠酶有顯著影響，其余因素對實驗影響不大。

3 結論

通過對影響果膠酶分配系數(shù)的雙水相萃取體系PEG/Na2HPO4萃取效果的各因素進行考察得，PEG1000質量濃度為26%，磷酸氫二鈉質量濃度為17%，pH為4.0，氯化鈉質量濃度為0.004%時，果膠酶的分配系數(shù)最大，達13.8954。實驗結果為果膠酶的萃取技術研究提供一定的理論依據(jù)。

[1]李祖明，張洪勛，白志輝，等.微生物果膠酶研究進展[J].生物技術通報，2010（3）：42-49.

[2]楊輝，張娟，王旭.PEG/（NH4）2SO4雙水相體系萃取果膠酶[J].食品科學，2007，28（6）：124-127.

[3]王旭，周慶禮.PEG/（NH4）2SO4雙水相萃取法提取果膠酶的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（9）：34-36.

[4]張娟，王博.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取果膠酶的研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2010（5）：95-97.

[5]張娟，王瑩，王博.果膠酶活力與稀釋倍數(shù)的測定與研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2009（2）：54-56.

[6]王永華.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2011：128.

[7]曾慶孝.果蔬采后生理生化實驗指導[M].北京：化學工業(yè)出版社，2009：160-163.

Study on two-phase aqueous extraction of pectinase from apple peel

WENG Xia，JIANG Xian-guang
（College of Chemistry and Life Sciences，Anshan Normal University，Anshan 114007，China）

Pectin enzyme was extracted with the apple peel as raw material.The extraction of pectinase in twophase aqueous system was investigated.Effects of concentrations of polyethylene glycol 1000，the concentrations of Na2HPO4，pH，the concentrations of NaCl on the extraction coefficient K were studied.Results showed that the optimum conditions were as follows：the mass composition in two-phase aqueous system PEG1000 26%，Na2HPO417%，NaCl 0.004%，pH4.0，the highest extraction coefficient K obtained in experiments could reached 13.8954.

aqueous two-phase system；pectinase；apple peel；enzyme activity

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0265-04

2013－05－21

翁霞（1979-），女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術。

鞍山師范學院院級科研項目（11kyxm05）。