汪修意，胡長(zhǎng)鷹，，*，虞 兵，歐仕益，王志偉

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）（2.廣東省普通高校產(chǎn)品包裝與物流重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海519070）

番木瓜葉中生物堿的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

汪修意1，胡長(zhǎng)鷹1，2，*，虞 兵1，歐仕益1，王志偉2

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）（2.廣東省普通高校產(chǎn)品包裝與物流重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海519070）

干燥的番木瓜葉用含1%HCl的90%乙醇溶液于常溫下提取5次，濃縮、過濾、石油醚脫脂，NH3·H2O調(diào)pH至8.0～9.0，三氯甲烷萃取，得生物堿粗提物。采用硅膠柱柱層析對(duì)粗體物進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，得到番木瓜堿，并通過IR、MS和NRM對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。

番木瓜葉，生物堿，番木瓜堿，結(jié)構(gòu)鑒定

番木瓜（CaricapapayaL.）屬于番木瓜科（Caricaceae），是一種多年生植物，主要種植在斯里蘭卡、印度、菲律賓、東赤道非洲、南美洲等熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)，這些地區(qū)一直將番木瓜作為傳統(tǒng)藥物用來治療多種疾病，甚至包括治療癌癥和傳染性疾病等[1-3]。番木瓜植物的幾乎所有部位都是良好的食用和藥用資源[4-6]。已有研究證實(shí)番木瓜植物中含有多種化學(xué)活性成分，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制物、生育酚、抗壞血酸、黃酮類、乙基β-D-果糖苷、生氰糖苷和硫代葡萄糖苷等[7-9]。生物堿類物質(zhì)也是番木瓜植物中的重要活性成分之一。據(jù)報(bào)道，番木瓜葉中含有4種生物堿，分別為番木瓜堿（carpaine）、偽番木瓜堿（pseudocarpaine）、去氫番木瓜堿I（dehydrocarpaine I）、去氫番木瓜堿II（dehydrocarpaine II），其中番木瓜堿的含量較高[10-11]。Tuffley等[12]研究認(rèn)為，番木瓜堿可以降低血壓和腸道條狀的心率運(yùn)動(dòng)，也可明顯使子宮松弛以及小支氣管擴(kuò)張。Ogan等[13]研究認(rèn)為，番木瓜堿具有抗癌活性以及驅(qū)蟲活性。Hornick等[14]研究認(rèn)為，番木瓜堿劑量從0.5～2.0mg/kg可逐步降低小鼠心臟的收縮和舒張壓，以及主動(dòng)脈的血壓，并證實(shí)劑量為2mg/kg時(shí)可減少心輸出量、心搏量、搏出能量以及心臟動(dòng)力。目前，對(duì)于番木瓜葉中生物堿的研究主要集中于其粗提物，單一物質(zhì)的研究鮮見報(bào)道，國內(nèi)還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要對(duì)番木瓜葉中的生物堿成分進(jìn)行了提取和分離，并鑒定出番木瓜堿單體，為尋找番木瓜植物中藥理活性成分以及其保健功能因子提供依據(jù)，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用番木瓜植物有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番木瓜葉 采自廣州市增城民聯(lián)番木瓜專業(yè)合作社；95%的乙醇、石油醚、三氯甲烷、氨水、次硝酸鉍鉀、碘化鉀、碘、濃鹽酸等 均為分析純；GF 254薄層色譜硅膠板 煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司；硅膠柱填料200～300目柱層層析硅膠 青島海洋化工廠分廠；TLC展開劑 三氯甲烷∶甲醇體積比85∶15，充分混合后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用；顯色劑 碘化鉍鉀溶液。

中型提取罐 常州市特威電氣自動(dòng)化系統(tǒng)有限公司；RE-52 AAB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；BS2-100自動(dòng)部分收集器、HL-1恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-1800紫外/可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；SYBO6-10泵 天津市科器高新技術(shù)公司；Avance500核磁共振儀 德國Bruker公司；4000Q TrapTM質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystems公司；EQUINOX55傅立葉紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司；ABI4000 Q TRAP液質(zhì)聯(lián)用儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番木瓜葉生物堿的提取[10-11]將95kg番木瓜鮮葉，在50℃條件下恒溫干燥48h，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得18kg的番木瓜葉干粉。取15kg干粉，用含1%HCl的90%乙醇溶液，按照料液比為1∶2（kg∶L），pH為4.0～5.0，在常溫條件下提取24h，重復(fù)提取操作5次。然后，在50℃條件下對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，殘余物過濾，用石油醚按照體積比為1∶2（L∶L）萃取脫脂，脫脂后用NH3·H2O調(diào)節(jié)水相pH至8.0～9.0，再用三氯甲烷按照體積比為1∶1（L∶L）萃取生物堿，在50℃條件下減壓回收三氯甲烷，得番木瓜葉生物堿粗提物53.35g。取上述部分生物堿粗提物溶于2%的HCl溶液中，制成生物堿鹽溶液，取四份（每份約1mL），分別滴加碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑進(jìn)行生物堿沉淀實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 番木瓜葉生物堿的薄層層析以及液質(zhì)檢測(cè) 取上述部分生物堿粗提物溶于5mL的三氯甲烷溶液，薄層點(diǎn)樣，展開劑為三氯甲烷∶甲醇（85∶15），顯色劑為稀碘化鉍鉀試液。首先在254、365nm紫外燈下觀察斑點(diǎn)，然后用顯色劑顯色后，再觀察斑點(diǎn)，比較斑點(diǎn)的數(shù)量及位置。再將樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈和乙酸銨，按照0～5min 12%的乙腈，5～25min 12%～23%的乙腈，25～35min 23%～30%的乙腈，35～55min 30%的乙腈，55～70min 30%～100%的乙腈[15]進(jìn)行線性梯度檢測(cè)。

1.2.3 番木瓜葉生物堿的分離 稱取350g硅膠于90～100℃條件下干燥2h，干燥器中冷卻，三氯甲烷潤(rùn)濕，裝于5cm×60cm的層析柱內(nèi)，用最初洗脫劑三氯甲烷∶甲醇（95∶5）進(jìn)行洗柱，壓實(shí)硅膠。取20g上述生物堿粗提物，溶于10～15mL的三氯甲烷，濕法上樣于硅膠柱中，以三氯甲烷∶甲醇（95∶5）為洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫液以50mL每管進(jìn)行收集，同時(shí)應(yīng)用TLC跟蹤檢測(cè)。將Rf值為0.78，有且只有一條清晰可見的橘紅色條帶的洗脫液，合并濃縮回收溶劑，將濃縮物再溶于2%的HCl溶液中，濾紙抽濾，0.45μm濾紙過濾，重復(fù)過濾操作多次，直至溶液澄清透明為止，用NH3·H2O調(diào)節(jié)pH，隨著NH3·H2O的不斷加入，有淡黃色沉淀逐漸生成，加至再無沉淀生成為止，再用0.45μm濾紙過濾得沉淀物。

1.2.4 沉淀物的鑒定 將上述沉淀物溶于甲醇，以甲醇為空白對(duì)照，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描測(cè)定；將沉淀物與KBr混合均勻壓片，進(jìn)行紅外吸收光譜鑒定；將沉淀物溶于甲醇，在離子源為ESI源條件下進(jìn)行MS鑒定；將沉淀物溶于三氯甲烷氘代試劑，在500MHz條件下進(jìn)行1H-NRM、13C-NRM、135DEPT和90DEPT鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿初步結(jié)果分析

在稀酸環(huán)境下，該粗提物能與碘-碘化鉀試劑生成棕褐色沉淀，能與碘化汞鉀試劑生成類白色沉淀，能與碘化鉍鉀試劑生成橘紅色沉淀，能與硅鎢酸試劑生成淺黃色沉淀，均有生物堿的沉淀反應(yīng)，可初步判斷粗提物中含有生物堿類物質(zhì)。

該粗提物經(jīng)優(yōu)化后的展開劑三氯甲烷∶甲醇（85∶15）展開，稀碘化鉍鉀溶液噴霧顯色，斑點(diǎn)為橘紅色，背景為淺黃色，清晰持久，經(jīng)觀察可能存在4種生物堿，Rf值分別為0.78、0.59、0.32、0.18。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道的4種生物堿的分子量在25.04、30.39、32.86、33.71min均被檢測(cè)到，分別為474去氫番木瓜堿II、478偽番木瓜堿、476去氫番木瓜堿I、478番木瓜堿。

2.2 沉淀物的鑒定分析

將過濾得到的沉淀物于室溫下干燥稱重，得淡黃色粉狀物質(zhì)1.51g，然后對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振鑒定。

2.2.1 沉淀物的全波長(zhǎng)掃描 由圖1可知，番木瓜葉分離得到的生物堿在304nm處有最大吸收，但整體對(duì)紫外的吸收強(qiáng)度都比較弱。

圖1 化合物的全波長(zhǎng)吸收光譜圖Fig.1 Full wavelength absorption spectra of compound

2.2.2 沉淀物的紅外（IR）吸收光譜 由圖2可知，沉淀物的紅外特征吸收波數(shù)為3322cm-1（＞N-H），2927cm-1（-CH3），2856cm-1（-CH2-），1716cm-1（＞C= O），1232cm-1（-O-），與楊秀偉等[16]以及國家醫(yī)藥管理局[17]公布的番木瓜堿的紅外吸收相近。

圖2 化合物的紅外吸收光譜圖Fig.2 The infrared absorption spectra of compound

2.2.3 沉淀物的質(zhì)譜（MS） 由圖3可知，ESI-MS中有m/z：479[M+H]+、495[M+NH3]+、501[M+Na]+等離子峰，表明該沉淀物的相對(duì)分子質(zhì)量為478。

2.2.4 沉淀物的核磁共振（NRM） 核磁數(shù)據(jù)經(jīng)MestReNova軟件解析得，1HNMR（500MHz，CDCl3）：δ 4.82（d，J=26.1Hz，2H），2.89（dt，J=12.1，6.1Hz，2H），2.61（d，J=7.2Hz，2H），2.48-2.39（m，2H），2.38-2.27（m，2H），2.10-1.96（m，2H），1.73-1.15（m，30H），1.09（t，J=18.3Hz，6H）。13C NMR（126MHz，CDCl3）：δ 173.51（s），70.36（s），56.04（s），53.62（s），37.43（s），34.61（s），29.78（s），29.14（s），28.76（s），28.72（s），26.42（s），25.51（s），25.39（s），18.71（s），與Sato等[18]、Govindachari等[19]以及Scifinder數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的一致。綜上所述，此沉淀物為番木瓜堿，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 化合物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of compound

圖4 番木瓜堿的結(jié)構(gòu)Fig.4 The structure of carpaine

由于番木瓜葉中的任一生物堿至今仍無標(biāo)準(zhǔn)品出售，也未見其檢測(cè)方法的研究報(bào)道，番木瓜堿純品的獲得與鑒定，有助于番木瓜堿檢測(cè)方法的建立，以及其生理功效的進(jìn)一步研究，同時(shí)，也為番木瓜堿分離工藝和方法的探究創(chuàng)造條件。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用硅膠柱柱層析以及化學(xué)沉淀法分離得到番木瓜堿純品，方法簡(jiǎn)單快速，產(chǎn)品純度高，為番木瓜葉中番木瓜堿的開發(fā)利用提供了更加快捷和簡(jiǎn)單的方法。

3 結(jié)論

本文通過生物堿沉淀法驗(yàn)證了番木瓜葉中含有生物堿類物質(zhì)，并通過展開劑為三氯甲烷∶甲醇（85∶15），顯色劑為碘化鉍鉀的薄層層析實(shí)驗(yàn)，以及液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了番木瓜葉中存在4種生物堿，利用硅膠柱柱層析以及化學(xué)沉淀法分離得到了番木瓜堿，并鑒定驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)，為其工藝探究創(chuàng)造條件，番木瓜葉中其余的生物堿還在進(jìn)一步研究中。

[1]Mello V J，Gomes M T R，Lemos F O，et al.The gastric ulcer protective and healing role of cysteine proteinases from Carica candamarcensis[J].Phytomedicine，2008，15（4）：237-244.

[2]Adebiyi A，Adaikan P G，Prasad R.Papaya（Carica papaya）consumption is unsafe in pregnancy：fact or fable?Scientific evaluation of a common belief in some parts of Asia using a rat model[J].British Journal of Nutrition，2002，88（2）：199-203.

[3]Munoz V，Sauvain M，Bourdy G，et al.The search for natural bioactive compounds through a multidisciplinary approach in Bolivia Part II Antimalarial activity of some plants used by Mosetene indians[J].Journal of Ethnopharmacology.2000，69（2）：139-155.

[4]Romasi E F，Karina J K，Parhusip A J N.Antibacterial activity of papaya leaf extracts against pathogenic bacteria[J].MAKARA of Technology Series，2012，15（2）：173-177.

[5]Anibijuwon I I，Udeze A O.Antimicrobial activity of Carica papaya（pawpaw leaf）on some pathogenic organisms of clinical origin from South-Western Nigeria[J].Ethnobotanical Leaflets，2009（7）：850-864.

[6]Dawkins G，Hewitt H，Wint Y，et al.Antibacterial effects of Carica papaya fruit on common wound organisms[J].The West Indian Medical Journal，2003，52（4）：290-292.

[7]Seigler D S，Pauli G F，Nahrstedt A，et al.Cyanogenic allosides and glucosides from Passiflora edulis and Carica papaya[J]. Phytochemistry，2002，60（8）：873-882.

[8]黃娟娟，胡長(zhǎng)鷹，潘慧芳.番木瓜中糖類成分的純化與鑒定[J].食品科學(xué)，2011，32（13）：89-93.

[9]胡長(zhǎng)鷹，潘慧芳.番木瓜中皂苷類成分的研究[J].食品科學(xué)，2010，31（7）：114-116.

[10]Tang C.New macrocyclic，Δ1-piperideine alkaloids from papaya leaves：dehydrocarpaine I and II[J].Phytochemistry，1979，18（4）：651-652.

[11]Tang C.Macrocyclic piperidine and piperideine alkaloids in Carica papaya[J].Trop Foods Chem Nutr，1979（1）：55-68.

[12]Tuffley B，Williams C H.The Pharmacology of Carpaine[J]. Australian J Pharm，1951，52：796-798.

[13]Ogan A U.The basic constituents of the leaves of Carica papaya[J].Phytochemistry，1971，10（10）：2544-2547.

[14]Hornick C A，Sanders L I，Lin Y C.Effect of carpaine，a papaya alkaloid，on the circulatory function in the rat[J].Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology，1978，22（2）：277.

[15]Jiao Z，Deng J，Li G，et al.Study on the compositional differences between transgenic and non-transgenic papaya（Carica papaya L.）[J].Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（6）：640-647.

[16]楊秀偉.生物堿[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：322.

[17]國家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：177.

[18]Sato T，Aoyagi S，Kibayashi C.Enantioselective total synthesis of（+）-azimine and（+）-carpaine[J].Organic Letters，2003，5（21）：3839-3842.

[19]Govindachari T R，Nagarajan K，Viswanathan N.Carpaine and pseudocarpaine[J].Tetrahedron Letters，1965，6（24）：1907-1916.

Isolation and structural identification of alkaloids of papaya leaves

WANG Xiu-yi1，HU Chang-ying1，2，*，YU Bing1，OU Shi-yi1，WANG Zhi-wei2
（1.Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Key Laboratory of Product Packaging and Logistics of Guangdong Higher Education Institutes，Zhuhai 519070，China）

Alkaloids were extracted five times from the dry papaya leaves by the solution of 90%ethanol contains 1%HCl.And then，the extract was concentrated，filtered，and degreased by petroleum ether.The acidity was adjusted to pH8.0～9.0 using concentrate NH3·H2O solution，and then extracted with excess chloroform.After purification of Silica gel column chromatography，alkaloids structural identification was performed with spectral methods（IR、MS、NMR）.The carpaine was isolated and identified.

papaya leaves；alkaloids；carpaine；structure identification

TS209

A

1002-0306（2014）06-0129-03

2013－07－22 *通訊聯(lián)系人

汪修意（1987-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品、天然產(chǎn)物提取。

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（10151063201000021）；珠海市科技攻關(guān)項(xiàng)目（PC20061044）。