于源華等

關(guān)鍵詞：氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細(xì)胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)作物防治蟲害的常用農(nóng)藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內(nèi)傳導(dǎo)；可經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種抑制體內(nèi)膽堿酯酶的神經(jīng)毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農(nóng)藥殘留和食品安全的問題備受關(guān)注。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測鮮有報(bào)道。我國現(xiàn)行氨基甲酸酯類農(nóng)藥國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準(zhǔn)確，但儀器體積大，對檢測人員的技術(shù)要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測方法對環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域意義重大。

近年來，非細(xì)胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優(yōu)點(diǎn)，在快速檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。非細(xì)胞體系是在細(xì)胞抽提物的酶系中合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)，具有穩(wěn)定、快速、高效等特點(diǎn)[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應(yīng)功能基因下游，構(gòu)建了定量檢測甾體激素的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到1.0 ng/L。本研究組在質(zhì)粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環(huán)芳烴的特異性響應(yīng)功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，構(gòu)建了定量檢測甾體激素及多環(huán)芳烴的非細(xì)胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構(gòu)建氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農(nóng)藥特異性響應(yīng)功能基因的調(diào)控序列，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構(gòu)建了檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，用于環(huán)境水體中的農(nóng)殘檢測。當(dāng)樣本中含有氨基甲酸酯類農(nóng)藥時(shí)EGFP表達(dá)并發(fā)光，熒光值在一定范圍內(nèi)與農(nóng)藥含量呈正相關(guān)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)公司）。

H5菌株（本實(shí)驗(yàn)室保存）、質(zhì)粒pKEGFP2（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液配制：呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養(yǎng)14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養(yǎng)基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構(gòu)建及功能基因調(diào)控序列的篩選

參照基因組文庫構(gòu)建方法[11]，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細(xì)胞，Kanamycin 抗性LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液在96孔微孔黑板中誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長475nm，發(fā)射波長509 nm，選取熒光強(qiáng)度與呋喃丹濃度正相關(guān)且熒光增強(qiáng)率（FE）最大的克隆子。

關(guān)鍵詞：氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細(xì)胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)作物防治蟲害的常用農(nóng)藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內(nèi)傳導(dǎo)；可經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種抑制體內(nèi)膽堿酯酶的神經(jīng)毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農(nóng)藥殘留和食品安全的問題備受關(guān)注。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測鮮有報(bào)道。我國現(xiàn)行氨基甲酸酯類農(nóng)藥國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準(zhǔn)確，但儀器體積大，對檢測人員的技術(shù)要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測方法對環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域意義重大。

近年來，非細(xì)胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優(yōu)點(diǎn)，在快速檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。非細(xì)胞體系是在細(xì)胞抽提物的酶系中合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)，具有穩(wěn)定、快速、高效等特點(diǎn)[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應(yīng)功能基因下游，構(gòu)建了定量檢測甾體激素的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到1.0 ng/L。本研究組在質(zhì)粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環(huán)芳烴的特異性響應(yīng)功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，構(gòu)建了定量檢測甾體激素及多環(huán)芳烴的非細(xì)胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構(gòu)建氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農(nóng)藥特異性響應(yīng)功能基因的調(diào)控序列，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構(gòu)建了檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，用于環(huán)境水體中的農(nóng)殘檢測。當(dāng)樣本中含有氨基甲酸酯類農(nóng)藥時(shí)EGFP表達(dá)并發(fā)光，熒光值在一定范圍內(nèi)與農(nóng)藥含量呈正相關(guān)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)公司）。

H5菌株（本實(shí)驗(yàn)室保存）、質(zhì)粒pKEGFP2（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液配制：呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養(yǎng)14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養(yǎng)基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構(gòu)建及功能基因調(diào)控序列的篩選

參照基因組文庫構(gòu)建方法[11]，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細(xì)胞，Kanamycin 抗性LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液在96孔微孔黑板中誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長475nm，發(fā)射波長509 nm，選取熒光強(qiáng)度與呋喃丹濃度正相關(guān)且熒光增強(qiáng)率（FE）最大的克隆子。

關(guān)鍵詞：氨基甲酸酯類農(nóng)藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細(xì)胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)作物防治蟲害的常用農(nóng)藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內(nèi)傳導(dǎo)；可經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種抑制體內(nèi)膽堿酯酶的神經(jīng)毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農(nóng)藥殘留和食品安全的問題備受關(guān)注。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測鮮有報(bào)道。我國現(xiàn)行氨基甲酸酯類農(nóng)藥國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準(zhǔn)確，但儀器體積大，對檢測人員的技術(shù)要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環(huán)境水體中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測方法對環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域意義重大。

近年來，非細(xì)胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優(yōu)點(diǎn)，在快速檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。非細(xì)胞體系是在細(xì)胞抽提物的酶系中合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)，具有穩(wěn)定、快速、高效等特點(diǎn)[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應(yīng)功能基因下游，構(gòu)建了定量檢測甾體激素的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到1.0 ng/L。本研究組在質(zhì)粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環(huán)芳烴的特異性響應(yīng)功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，構(gòu)建了定量檢測甾體激素及多環(huán)芳烴的非細(xì)胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達(dá)到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構(gòu)建氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農(nóng)藥特異性響應(yīng)功能基因的調(diào)控序列，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構(gòu)建了檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的非細(xì)胞體系生物熒光傳感器，用于環(huán)境水體中的農(nóng)殘檢測。當(dāng)樣本中含有氨基甲酸酯類農(nóng)藥時(shí)EGFP表達(dá)并發(fā)光，熒光值在一定范圍內(nèi)與農(nóng)藥含量呈正相關(guān)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)公司）。

H5菌株（本實(shí)驗(yàn)室保存）、質(zhì)粒pKEGFP2（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液配制：呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養(yǎng)14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養(yǎng)基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構(gòu)建及功能基因調(diào)控序列的篩選

參照基因組文庫構(gòu)建方法[11]，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細(xì)胞，Kanamycin 抗性LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)液在96孔微孔黑板中誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長475nm，發(fā)射波長509 nm，選取熒光強(qiáng)度與呋喃丹濃度正相關(guān)且熒光增強(qiáng)率（FE）最大的克隆子。