劉振　孫洋

摘要：建立高效快速、操作簡便、價格低廉的乳品真蛋白檢測方法具有重要意義。本實驗合成了具有雙羧基官能團的水溶性1，8萘酰亞胺熒光探針2，探針2對酪蛋白具有特異性發(fā)光效應，其機理是雙羧基為前導嵌入基團插入酪蛋白膠團子域的疏水腔中，與色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基以氫鍵及疏水作用相結合后使酪蛋白膠團結構收縮，萘酰亞胺熒光基元吸附于酪蛋白膠團表面呈現(xiàn)聚集誘導發(fā)光效應 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm為激發(fā)波長，一定范圍內(nèi)探針2在480 nm附近處發(fā)光強度與酪蛋白濃度成正比，在pH 5.5條件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；線性范圍為0.1～9.5 mg/L，檢出限 （3σ）為2.9 mg/L，對不同濃度酪蛋白平行測定9次，相對標準偏差<3%；三聚氰胺、銨肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型膠原蛋白及粗卵清蛋白等對于測定結果無顯著影響（±5%），用于奶粉中總酪蛋白含量的測定結果與雙縮脲法相一致。

關鍵詞：1，8萘酰亞胺； 雙羧基； 酪蛋白； 聚集誘導發(fā)光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白構成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白量的80%，主要以膠團形式存在。酪蛋白是以磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。由于國標中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、 銨肥、 三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法行為，嚴重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費者的健康。目前現(xiàn)行的乳品中蛋白質(zhì)的檢測方法[3]會受脂肪及碳水化合物等因素干擾，尤其該法對水解蛋白及動物蛋白等劣質(zhì)蛋白具有相似的響應作用，同樣為不法分子摻加劣質(zhì)蛋白以提高蛋白質(zhì)含量提供可乘之機。為此亟需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、 高效的真蛋白檢測方法。

目前， 酪蛋白檢測方法有凱氏定氮法[4]、 雙縮脲法[5]、 四階導數(shù)分光光度法[6]、 液質(zhì)聯(lián)用法[7]、 ELISA法[8]、 電泳法[9]、 蛋白質(zhì)免疫印跡[10]、 反相色譜[11]、芯片[12]及熒光探針法[13]。但這些方法都具有不同程度的局限性，如靈敏度和選擇性較差、檢測儀器價格昂貴、操作過程復雜等。近來，Wang等[13]報道了基于BSPOTPE探針對酪蛋白膠團微環(huán)境極性的改變產(chǎn)生聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的檢測方法，但探針只影響酪蛋白微環(huán)境的極性，并未與酪蛋白膠團發(fā)生結合作用。

本課題組報道了1，8萘酰亞胺類熒光探針與酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本實驗合成了新型雙羧基水溶性1，8萘酰亞胺類熒光探針2，研究了酪蛋白對探針2的聚集誘導發(fā)光效應的機理，根據(jù)探針2對酪蛋白特異性的識別作用，建立了酪蛋白檢測新方法并應用于實際奶粉中總酪蛋白含量的測定。本方法具有快速高效等特點，為乳品質(zhì)量安全監(jiān)測提供了重要信息。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

2.3光譜測定

以280 nm為激發(fā)波長，300～400 nm范圍內(nèi)測定酪蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜；以300 nm為激發(fā)波長，在440～600 nm范圍內(nèi)測定探針2與酪蛋白體系發(fā)射光譜，入射和出射狹縫帶寬均為5 nm。

3結果與討論

3.1探針2與酪蛋白聚集誘導發(fā)光機理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的80%，主要以膠團狀態(tài)存在于乳品中，它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4個色氨酸殘基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1個色氨酸殘基， 分別為Trp143和176。除此之外， 酪蛋白還含有大量疏水性的酪氨酸殘基。色氨酸和酪氨酸殘基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之間，對于酪蛋白膠團的自組裝具有重要作用，同時也是酪蛋白在350 nm附近內(nèi)源性熒光的主要體現(xiàn)基團[17]。作者設想探針2的雙羧基作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔中，與色氨酸和酪氨酸殘基以非共價鍵作用，如疏水、氫鍵作用等相結合，導致未結合的氨基酸殘基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白膠團結構更加緊實；而1，8萘酰亞胺熒光基元則吸附于膠團表面導致探針分子的聚集，引起聚集誘導發(fā)光效應[18]。

以300 nm為激發(fā)波長，考察了酪蛋白對探針2熒光光譜的影響（pH 7.4），如圖2A所示，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2在480 nm附近呈現(xiàn)顯著的熒光增強并伴隨最大發(fā)射峰藍移；圖2B為濃度為0～5.0 g/L的酪蛋白對探針2顏色的影響，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2的發(fā)光效應逐漸增強；結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，形成新的發(fā)光復合物，并且復合物的疏水性隨著酪蛋白濃度的增加而逐漸增大。

為了研究酪蛋白與探針2的熒光增強機理，考察了不同濃度探針2對酪蛋白熒光及吸收光譜的影響（pH 7.4），酪蛋白的內(nèi)源性熒光主要由色氨酸和酪氨酸體現(xiàn)，如圖3A所示，當激發(fā)波長為280 nm時，酪蛋白在350 nm附近呈現(xiàn)特征熒光峰，探針2在395 nm處呈微弱熒光，隨著探針2濃度的增加，酪蛋白熒光被逐漸猝滅并伴隨顯著的藍移；同時在475 nm附近出現(xiàn)新的發(fā)射峰，且光強逐漸增大，發(fā)射峰向短波長方向移動。結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)色團的疏水性增加，包埋進疏水腔中；而450 nm附近新峰的出現(xiàn)表明形成了探針2酪蛋白復合物，且復合物的疏水性隨著探針2濃度的增加而逐漸增大。此外在400 nm處出現(xiàn)的等吸收點表明酪蛋白從游離態(tài)向探針2的結合態(tài)轉變。

摘要：建立高效快速、操作簡便、價格低廉的乳品真蛋白檢測方法具有重要意義。本實驗合成了具有雙羧基官能團的水溶性1，8萘酰亞胺熒光探針2，探針2對酪蛋白具有特異性發(fā)光效應，其機理是雙羧基為前導嵌入基團插入酪蛋白膠團子域的疏水腔中，與色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基以氫鍵及疏水作用相結合后使酪蛋白膠團結構收縮，萘酰亞胺熒光基元吸附于酪蛋白膠團表面呈現(xiàn)聚集誘導發(fā)光效應 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm為激發(fā)波長，一定范圍內(nèi)探針2在480 nm附近處發(fā)光強度與酪蛋白濃度成正比，在pH 5.5條件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；線性范圍為0.1～9.5 mg/L，檢出限 （3σ）為2.9 mg/L，對不同濃度酪蛋白平行測定9次，相對標準偏差<3%；三聚氰胺、銨肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型膠原蛋白及粗卵清蛋白等對于測定結果無顯著影響（±5%），用于奶粉中總酪蛋白含量的測定結果與雙縮脲法相一致。

關鍵詞：1，8萘酰亞胺； 雙羧基； 酪蛋白； 聚集誘導發(fā)光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白構成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白量的80%，主要以膠團形式存在。酪蛋白是以磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。由于國標中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、 銨肥、 三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法行為，嚴重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費者的健康。目前現(xiàn)行的乳品中蛋白質(zhì)的檢測方法[3]會受脂肪及碳水化合物等因素干擾，尤其該法對水解蛋白及動物蛋白等劣質(zhì)蛋白具有相似的響應作用，同樣為不法分子摻加劣質(zhì)蛋白以提高蛋白質(zhì)含量提供可乘之機。為此亟需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、 高效的真蛋白檢測方法。

目前， 酪蛋白檢測方法有凱氏定氮法[4]、 雙縮脲法[5]、 四階導數(shù)分光光度法[6]、 液質(zhì)聯(lián)用法[7]、 ELISA法[8]、 電泳法[9]、 蛋白質(zhì)免疫印跡[10]、 反相色譜[11]、芯片[12]及熒光探針法[13]。但這些方法都具有不同程度的局限性，如靈敏度和選擇性較差、檢測儀器價格昂貴、操作過程復雜等。近來，Wang等[13]報道了基于BSPOTPE探針對酪蛋白膠團微環(huán)境極性的改變產(chǎn)生聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的檢測方法，但探針只影響酪蛋白微環(huán)境的極性，并未與酪蛋白膠團發(fā)生結合作用。

本課題組報道了1，8萘酰亞胺類熒光探針與酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本實驗合成了新型雙羧基水溶性1，8萘酰亞胺類熒光探針2，研究了酪蛋白對探針2的聚集誘導發(fā)光效應的機理，根據(jù)探針2對酪蛋白特異性的識別作用，建立了酪蛋白檢測新方法并應用于實際奶粉中總酪蛋白含量的測定。本方法具有快速高效等特點，為乳品質(zhì)量安全監(jiān)測提供了重要信息。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

2.3光譜測定

以280 nm為激發(fā)波長，300～400 nm范圍內(nèi)測定酪蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜；以300 nm為激發(fā)波長，在440～600 nm范圍內(nèi)測定探針2與酪蛋白體系發(fā)射光譜，入射和出射狹縫帶寬均為5 nm。

3結果與討論

3.1探針2與酪蛋白聚集誘導發(fā)光機理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的80%，主要以膠團狀態(tài)存在于乳品中，它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4個色氨酸殘基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1個色氨酸殘基， 分別為Trp143和176。除此之外， 酪蛋白還含有大量疏水性的酪氨酸殘基。色氨酸和酪氨酸殘基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之間，對于酪蛋白膠團的自組裝具有重要作用，同時也是酪蛋白在350 nm附近內(nèi)源性熒光的主要體現(xiàn)基團[17]。作者設想探針2的雙羧基作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔中，與色氨酸和酪氨酸殘基以非共價鍵作用，如疏水、氫鍵作用等相結合，導致未結合的氨基酸殘基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白膠團結構更加緊實；而1，8萘酰亞胺熒光基元則吸附于膠團表面導致探針分子的聚集，引起聚集誘導發(fā)光效應[18]。

以300 nm為激發(fā)波長，考察了酪蛋白對探針2熒光光譜的影響（pH 7.4），如圖2A所示，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2在480 nm附近呈現(xiàn)顯著的熒光增強并伴隨最大發(fā)射峰藍移；圖2B為濃度為0～5.0 g/L的酪蛋白對探針2顏色的影響，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2的發(fā)光效應逐漸增強；結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，形成新的發(fā)光復合物，并且復合物的疏水性隨著酪蛋白濃度的增加而逐漸增大。

為了研究酪蛋白與探針2的熒光增強機理，考察了不同濃度探針2對酪蛋白熒光及吸收光譜的影響（pH 7.4），酪蛋白的內(nèi)源性熒光主要由色氨酸和酪氨酸體現(xiàn)，如圖3A所示，當激發(fā)波長為280 nm時，酪蛋白在350 nm附近呈現(xiàn)特征熒光峰，探針2在395 nm處呈微弱熒光，隨著探針2濃度的增加，酪蛋白熒光被逐漸猝滅并伴隨顯著的藍移；同時在475 nm附近出現(xiàn)新的發(fā)射峰，且光強逐漸增大，發(fā)射峰向短波長方向移動。結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)色團的疏水性增加，包埋進疏水腔中；而450 nm附近新峰的出現(xiàn)表明形成了探針2酪蛋白復合物，且復合物的疏水性隨著探針2濃度的增加而逐漸增大。此外在400 nm處出現(xiàn)的等吸收點表明酪蛋白從游離態(tài)向探針2的結合態(tài)轉變。

摘要：建立高效快速、操作簡便、價格低廉的乳品真蛋白檢測方法具有重要意義。本實驗合成了具有雙羧基官能團的水溶性1，8萘酰亞胺熒光探針2，探針2對酪蛋白具有特異性發(fā)光效應，其機理是雙羧基為前導嵌入基團插入酪蛋白膠團子域的疏水腔中，與色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基以氫鍵及疏水作用相結合后使酪蛋白膠團結構收縮，萘酰亞胺熒光基元吸附于酪蛋白膠團表面呈現(xiàn)聚集誘導發(fā)光效應 （Aggregation induced emission， AIE）。以300 nm為激發(fā)波長，一定范圍內(nèi)探針2在480 nm附近處發(fā)光強度與酪蛋白濃度成正比，在pH 5.5條件下建立了酪蛋白AIE定量分析方法；線性范圍為0.1～9.5 mg/L，檢出限 （3σ）為2.9 mg/L，對不同濃度酪蛋白平行測定9次，相對標準偏差<3%；三聚氰胺、銨肥、尿素、乳清蛋白、血清蛋白、I型膠原蛋白及粗卵清蛋白等對于測定結果無顯著影響（±5%），用于奶粉中總酪蛋白含量的測定結果與雙縮脲法相一致。

關鍵詞：1，8萘酰亞胺； 雙羧基； 酪蛋白； 聚集誘導發(fā)光

1引言

乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白（包括乳白蛋白和乳球蛋白）及少量脂肪球膜蛋白，上述蛋白構成了乳中的“真蛋白”[1]。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白量的80%，主要以膠團形式存在。酪蛋白是以磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、 αs2酪蛋白、 β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。由于國標中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、 銨肥、 三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法行為，嚴重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費者的健康。目前現(xiàn)行的乳品中蛋白質(zhì)的檢測方法[3]會受脂肪及碳水化合物等因素干擾，尤其該法對水解蛋白及動物蛋白等劣質(zhì)蛋白具有相似的響應作用，同樣為不法分子摻加劣質(zhì)蛋白以提高蛋白質(zhì)含量提供可乘之機。為此亟需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、 高效的真蛋白檢測方法。

目前， 酪蛋白檢測方法有凱氏定氮法[4]、 雙縮脲法[5]、 四階導數(shù)分光光度法[6]、 液質(zhì)聯(lián)用法[7]、 ELISA法[8]、 電泳法[9]、 蛋白質(zhì)免疫印跡[10]、 反相色譜[11]、芯片[12]及熒光探針法[13]。但這些方法都具有不同程度的局限性，如靈敏度和選擇性較差、檢測儀器價格昂貴、操作過程復雜等。近來，Wang等[13]報道了基于BSPOTPE探針對酪蛋白膠團微環(huán)境極性的改變產(chǎn)生聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象 （Aggregation induced emission， AIE），并建立了酪蛋白的檢測方法，但探針只影響酪蛋白微環(huán)境的極性，并未與酪蛋白膠團發(fā)生結合作用。

本課題組報道了1，8萘酰亞胺類熒光探針與酪蛋白相互作用后的AIE特性[14～16]。本實驗合成了新型雙羧基水溶性1，8萘酰亞胺類熒光探針2，研究了酪蛋白對探針2的聚集誘導發(fā)光效應的機理，根據(jù)探針2對酪蛋白特異性的識別作用，建立了酪蛋白檢測新方法并應用于實際奶粉中總酪蛋白含量的測定。本方法具有快速高效等特點，為乳品質(zhì)量安全監(jiān)測提供了重要信息。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

2.3光譜測定

以280 nm為激發(fā)波長，300～400 nm范圍內(nèi)測定酪蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜；以300 nm為激發(fā)波長，在440～600 nm范圍內(nèi)測定探針2與酪蛋白體系發(fā)射光譜，入射和出射狹縫帶寬均為5 nm。

3結果與討論

3.1探針2與酪蛋白聚集誘導發(fā)光機理

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的80%，主要以膠團狀態(tài)存在于乳品中，它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復合體，主要分為αsl酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白4種[2]。其中αs1酪蛋白和αs2酪蛋白含有4個色氨酸殘基， 包括Trp164， 199， 109和193； 而β酪蛋白和κ酪蛋白各自含有1個色氨酸殘基， 分別為Trp143和176。除此之外， 酪蛋白還含有大量疏水性的酪氨酸殘基。色氨酸和酪氨酸殘基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之間，對于酪蛋白膠團的自組裝具有重要作用，同時也是酪蛋白在350 nm附近內(nèi)源性熒光的主要體現(xiàn)基團[17]。作者設想探針2的雙羧基作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔中，與色氨酸和酪氨酸殘基以非共價鍵作用，如疏水、氫鍵作用等相結合，導致未結合的氨基酸殘基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白膠團結構更加緊實；而1，8萘酰亞胺熒光基元則吸附于膠團表面導致探針分子的聚集，引起聚集誘導發(fā)光效應[18]。

以300 nm為激發(fā)波長，考察了酪蛋白對探針2熒光光譜的影響（pH 7.4），如圖2A所示，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2在480 nm附近呈現(xiàn)顯著的熒光增強并伴隨最大發(fā)射峰藍移；圖2B為濃度為0～5.0 g/L的酪蛋白對探針2顏色的影響，隨著酪蛋白濃度的增加，探針2的發(fā)光效應逐漸增強；結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，形成新的發(fā)光復合物，并且復合物的疏水性隨著酪蛋白濃度的增加而逐漸增大。

為了研究酪蛋白與探針2的熒光增強機理，考察了不同濃度探針2對酪蛋白熒光及吸收光譜的影響（pH 7.4），酪蛋白的內(nèi)源性熒光主要由色氨酸和酪氨酸體現(xiàn)，如圖3A所示，當激發(fā)波長為280 nm時，酪蛋白在350 nm附近呈現(xiàn)特征熒光峰，探針2在395 nm處呈微弱熒光，隨著探針2濃度的增加，酪蛋白熒光被逐漸猝滅并伴隨顯著的藍移；同時在475 nm附近出現(xiàn)新的發(fā)射峰，且光強逐漸增大，發(fā)射峰向短波長方向移動。結果表明，探針2與酪蛋白發(fā)生結合作用，酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)色團的疏水性增加，包埋進疏水腔中；而450 nm附近新峰的出現(xiàn)表明形成了探針2酪蛋白復合物，且復合物的疏水性隨著探針2濃度的增加而逐漸增大。此外在400 nm處出現(xiàn)的等吸收點表明酪蛋白從游離態(tài)向探針2的結合態(tài)轉變。