唐 清，王森弘，李燕君，楊 盛，徐曉玉

（西南大學藥學院/中醫(yī)藥學院，西南大學中藥研究所，重慶市藥效評價工程技術研究中心，重慶市銀花工程技術研究中心，重慶400716）

雙花露純天然植物飲料成分分析

唐 清，王森弘，李燕君，楊 盛，徐曉玉*

（西南大學藥學院/中醫(yī)藥學院，西南大學中藥研究所，重慶市藥效評價工程技術研究中心，重慶市銀花工程技術研究中心，重慶400716）

對雙花露純天然植物飲料中所含藥用有效成分及營養(yǎng)成分的含量進行了檢測。RP-HPLC法、紫外分光光度法、氨基酸自動分析儀法和原子吸收光譜法分別用于檢測綠原酸、總黃酮、氨基酸和礦質元素的含量。結果表明：雙花露純天然植物飲料中所含綠原酸含量為301.61μg/mL，總黃酮含量為2.93mg/mL，氨基酸總含量為2.607mg/100mL，礦質元素Fe、Ca、K、Na、Mg、Zn的含量分別為2.65、4.66、119.55、101.47、11.36、0.52μg/mL。雙花露純天然植物飲料含有豐富的藥用有效成分及營養(yǎng)成分，值得進一步推廣。

雙花露純天然植物飲料，綠原酸，總黃酮，氨基酸，礦質元素

雙花露純天然植物飲料為西南大學藥學院研發(fā)的一款純天然植物飲品，其主要原料為秀山銀花與杭白菊。

秀山銀花產于重慶秀山縣，主要品種為灰氈毛忍冬。2005年版《中國藥典》（一部）首次將灰氈毛忍冬歸類為山銀花，并對其作了詳細的描述[1]，其氣清香，味微苦甘，性味歸經(jīng)、功能主治等均與忍冬一致。經(jīng)馮彬彬等[2]測定，秀山銀花所含有效成分綠原酸的含量高達9.03%，比山東平邑（4.08%）和河南封丘（3.79%）等地所產金銀花的綠原酸含量均高出很多。杭白菊為菊科多年生草本植物，盛產于浙江桐鄉(xiāng)市、海寧市，其花瓣潔白如玉，花蕊黃如純金，古時曾作貢品，素有“千葉玉玲瓏”的美名。杭白菊不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且具有很高的藥用功效，含有揮發(fā)油、總黃酮、綠原酸等有效成分，常飲能散風清熱、平肝明目、消疲怡神[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，杭白菊具有抗氧化[4]、保護心血管[5]、降血脂[6]、抗菌消炎[7]及抗腫瘤[8]等作用。

雙花露純天然植物飲料含有多種藥用有效成分及營養(yǎng)成分。本文主要測定雙花露純天然植物飲料中所含綠原酸、總黃酮、氨基酸、礦質元素等成分的含量，為雙花露純天然植物飲料的進一步推廣提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙花露 重慶秀滄生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司，批號：20130424A，食品生產許可證號：QS501506010093，規(guī)格：248mL；綠原酸對照品 中國藥品生物制品檢定所，純度96.6%；蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所，純度92.5%；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇、氫氧化鉀、無水乙醇、硝酸、高氯酸、硫酸、硫代硫酸鈉、石油醚、乙醚等 成都科龍化工廠，分析純。

1200型高效液相色譜儀 帶紫外檢測器，美國Agilent technologies；L-8800型全自動氨基酸分析、U-3010型儀紫外可見分光光度計 日本HITACHI公司；TAS-990型原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；超聲波清洗器、萬分之一電子天平、pH計、EL2046型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸含量檢測

1.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品0.0710g，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為710μg/mL的標準品貯備液。

1.2.1.2 樣品溶液的制備 準確量取5mL飲料樣品于蒸發(fā)皿中，80℃恒溫水浴鍋上蒸干，用50%的甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，過濾，得到樣品溶液。

1.2.1.3 色譜條件 platisil ODS色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm）；以0.2%H3PO4∶乙腈=87∶13為流動相；檢測波長326nm；進樣量20μL；流速為1.0mL/min；柱溫25℃。

1.2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取濃度為710μg/mL的標準品母液配制成以下5個濃度：71.0、42.6、28.4、14.2、7.1μg/mL，用0.22μm微孔濾膜過濾后，置于樣品瓶中，按照上述色譜條件進行HPLC測定，作峰面積對濃度的標準曲線，求出線性回歸方程。

1.2.1.5 樣品分析 在相同的色譜條件下，將樣品溶液注入液相色譜儀中進行HPLC測定，采用外標法進行定量[9]。

1.2.2 總黃酮含量檢測

1.2.2.1 對照品溶液的制備 稱取0.2000g干燥至恒重的無水蘆丁，置于100mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，得2.00mg/mL標準貯備溶液。吸取10.00mL蘆丁標準貯備溶液于100mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到0.2mg/mL的蘆丁對照品溶液[10]。

1.2.2.2 樣品溶液的制備 準確量取5mL飲料樣品，置于蒸發(fā)皿中，80℃恒溫水浴鍋上蒸干，用50%甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，過濾，得到樣品溶液。

1.2.2.3 顯色方法及檢測波長的選擇 精密吸取蘆丁對照品溶液及樣品溶液各2mL置于25mL容量瓶中，補水至約10mL，以空白試劑為對照，加1.0mL 50g/L亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min，加1.0mL 100g/L硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min，加4.0mL 200g/L氫氧化鈉溶液，再加水至刻度，搖勻，放置15min。用1cm比色皿，400～800nm波長范圍內進行掃描，選取最大吸收波長為檢測波長。

1.2.2.4 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、9.00mL置于25.00mL容量瓶中。按“1.2.2.3”中方法，以相應試劑作空白，分別在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標（Y），以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標（X），繪制標準曲線。

1.2.2.5 樣品分析 精密吸取2mL樣品溶液，按“1.2.2.3”中方法，以相應試劑作空白，在最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品的總黃酮含量（以蘆丁計）。

1.2.3 氨基酸的檢測

1.2.3.1 樣品處理 準確量取飲料樣品250mL置于圓底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至50mL。取5mL濃縮液置于50mL燒杯中，加入0.2mL 4%磺基水楊酸溶液振蕩搖勻，用0.22μm濾膜過濾，備用[11]。

1.2.3.2 分析條件 一個樣品分析周期53min，儀器設有分離柱和反應柱，即a.分離柱（4.6mm×60mm）：柱溫700℃、柱壓10.678MPa、洗脫液以0.4mL/min流速流經(jīng)此柱；b.反應柱：柱溫1350℃、柱壓0.982MPa、茚三酮及茚三酮緩沖液以0.35mL/min流速流經(jīng)此柱。

1.2.4 礦質元素分析

1.2.4.1 樣品處理 稱取飲料樣品5.0g，置于50mL錐形瓶中。加入消化液10mL（硝酸∶高氯酸=4∶1），混勻，150℃油浴加熱消化至澄清透明。放冷，用5%硝酸溶液洗滌錐形瓶，洗液轉入25mL容量瓶中，稀釋至刻度[12]，備用。

1.2.4.2 分析條件 按原子吸收光譜法測定Fe、Na、Ca、K、Mg、Zn的含量。原子吸收光譜檢測條件見表1。

表1 原子吸收光譜儀工作條件Table.1 Working conditions of AAS assay

2 結果與分析

2.1 綠原酸的含量測定結果

2.1.1 標準曲線 以對照品濃度為橫坐標（x），色譜峰面積為縱坐標作圖（y），得到線性回歸方程為：y= 5.2065x-5.5733，r=0.9999。表明綠原酸濃度在7.1～71.0μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.1.2 精密度實驗 取對照品溶液適量，重復進樣6次，測定綠原酸的含量。計算得相對標準偏差（RSD）＝0.039%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12、24h進樣，測定綠原酸的含量。結果見表2，RSD＝1.31%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.1.4 重復性實驗 精密量取同一批樣品，共6份，每份約5mL，分別按“1.2.1.2”項下方法制備樣品溶液，測定綠原酸的含量。結果見表3，RSD＝1.01%，表明方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收率實驗 量取9份已知含量的樣品5mL，分別加入對照品3個濃度梯度共9份，按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表4。

2.1.6 樣品含量的測定 取3批樣品（批號：20130423、20130424、20130510）各5mL，分別按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，取20μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積，計算含量。結果顯示，3批樣品中綠原酸的含量分別為290.15、305.23、309.44μg/mL，平均含量為301.61μg/mL。

表2 穩(wěn)定性實驗結果（，n=3）Table.2 Stability test results（，n=3）

表2 穩(wěn)定性實驗結果（，n=3）Table.2 Stability test results（，n=3）

時間（h） 0 2 4 6 8 12 24 RSD（%）綠原酸含量（μg/mL） 305.27±0.72 304.79±0.29 304.50±0.77 304.21±0.58 303.35±1.44 302.29±0.60 301.81±0.48 1.31

表3 重復性實驗結果（，n=3）Table.3 Reproducibility test results（，n=3）

表3 重復性實驗結果（，n=3）Table.3 Reproducibility test results（，n=3）

編號 1 2 3 4 5 6 RSD（%）綠原酸含量（μg/mL） 305.74±0.93 304.05±0.38 306.23±0.77 306.90±0.67 304.88±1.34 305.17±1.06 1.01

表4 加樣回收率實驗結果（，n=3）Table.4 Recovery test results（，n=3）

表4 加樣回收率實驗結果（，n=3）Table.4 Recovery test results（，n=3）

編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9RSD（%）回收率（%） 96.7±0.3 95.3±0.4 102.4±0.6 99.3±0.2 100.2±0.1 103.4±0.4 107.8±0.8 104.4±0.6 109.2±0.4 4.7

圖1為綠原酸含量測定液相色譜圖，在流動相為0.2%H3PO4∶乙腈=87∶13時，樣品中的綠原酸達到很好的分離效果。

圖1 綠原酸含量測定色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of chlorogenic acid

2.2 總黃酮的含量測定結果

2.2.1 最大檢測波長的確定及標準曲線線性關系考察 紫外掃描結果顯示（圖2），在510nm處蘆丁對照品有最大吸收，且該波長處樣品也有較強吸收，故確定檢測波長為510nm。經(jīng)線性回歸表明，蘆丁濃度在8～72μg/mL范圍內呈良好的線性關系?；貧w方程為：y=0.0121x+0.0021，r=0.9999。

圖2 總黃酮UV掃描圖譜Fig.2 UV graphs of total flavonoids

2.2.2 精密度實驗 精密量取蘆丁標準對照品溶液6份，置于10mL試管中，參照“1.2.2.3”中方法，在510nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算各份總黃酮含量。結果RSD=0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗 精密量取樣品溶液適量，參照“1.2.2.3”中方法操作，顯色后不同時間測定其吸光度變化，即放置5、10、15、30、45、60、90、120、150min后，分別測定其吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算總黃酮含量。結果見表5，RSD=1.22%，表明方法穩(wěn)定性較好。

2.2.4 重復性實驗 精密量取同一批號飲料樣品6份，每份約5mL，照樣品溶液制備方法制備。精密吸取各樣品溶液適量，參照“1.2.2.3”方法操作，在510nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線的回歸方程計算各份總黃酮含量。結果見表6，RSD=1.22%，表明方法重復性良好。

表5 穩(wěn)定性實驗結果（，n=3）Table.5 Stability test results（，n=3）

表5 穩(wěn)定性實驗結果（，n=3）Table.5 Stability test results（，n=3）

時間（min） 0 5 10 15 30 45 60 90 120 150 RSD（%）總黃酮含量（mg/mL） 2.91±0.01 2.91±0.01 2.90±0.01 2.89±0.00 2.88±0.01 2.87±0.01 2.86±0.01 2.85±0.00 2.82±0.01 2.80±0.01 1.22

表6 重復性實驗結果（，n=3）Table.6 Reproducibility test results（，n=3）

表6 重復性實驗結果（，n=3）Table.6 Reproducibility test results（，n=3）

編號 1 2 3 4 5 6 RSD（%）總黃酮含量（mg/mL） 2.77±0.01 2.76±0.00 2.80±0.01 2.85±0.01 2.79±0.01 2.84±0.00 1.01

表7 加樣回收率實驗結果（，n=3）Table.7 Recovery test results（，n=3）

表7 加樣回收率實驗結果（，n=3）Table.7 Recovery test results（，n=3）

編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9RSD（%）回收率（%） 102.4±0.4 103.2±0.2 102.4±0.4 101.7±0.7 101.7±0.2 105.4±0.3 103.2±0.0 103±0.2 103.2±0.2 1.1

2.2.5 加樣回收率實驗 精密量取已知總黃酮含量飲料樣品9份，每份約5mL，置于25mL的量瓶中，再按80%、80%、80%、100%、100%、100%、120%、120%、120%加入蘆丁對照品，各份均照樣品溶液制備方法制備。精密吸取各樣品溶液適量，參照“1.2.2.3”中方法操作，在510nm處測定吸光度。計算加樣回收率，結果見表7。

2.2.6 樣品含量的測定 取3批樣品（批號：20130423、20130424、20130510）各5mL，按“1.2.2.2”中方法處理樣品，按“1.2.2.3”中的方法檢測各個樣品的吸光度值，計算其總黃酮含量。結果顯示：3批樣品分別為2.81、3.01、2.96mg/mL，平均含量為2.93mg/mL。

2.3 氨基酸檢測結果

利用氨基酸自動分析儀共檢測了17種氨基酸，檢測結果見表8。其中脯氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸及苯丙氨酸含量較為豐富，均高于0.1mg/mL。圖3為氨基酸的分離圖譜，各氨基酸分離良好。

表8 氨基酸檢測結果（n=3）Table.8 Detection result of amino acids（n=3）

2.4 礦質元素分析結果

利用原子吸收光譜法共檢測了6種礦質元素的含量，檢測結果如表9所示。其中K、Na、Ca、Mg四種元素為常量元素，含量較高，而Fe和Zn為微量元素，含量相對較低。

圖3 雙花露中各氨基酸的分離圖譜Fig.3 Chromatogram of each amino acid in Shuang Hua Botanical Beverage

表9 礦質元素含量測定結果（n=3）Table.9 Content of mineral elements（n=3）

3 結論與討論

綠原酸是秀山銀花中的主要藥效物質之一，具有多種生物藥理活性[13]。如抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等。黃酮類化合物是植物中分布最廣泛的一類物質，它們常以游離態(tài)或與糖結合成苷的形式存在[14]。黃酮類化合物不僅具有較強的天然抗氧化性，而且具有強有力的自由基清除性。此外，黃酮類化合物還被證實有較強的生物活性，如預防心血管疾病、抗衰老、抗菌、抗病毒、防癌抗癌、調節(jié)免疫等[15]。檢測結果顯示雙花露純天然植物飲料中綠原酸含量為301.61μg/mL，總黃酮含量為2.93mg/mL，濃度均較高，是該飲料中主要的功能性物質。

氨基酸與礦質元素均為雙花露純天然植物飲料中重要的營養(yǎng)成分。氨基酸組成和含量是評價蛋白質量的重要指標[16]。雙花露純天然植物飲料中氨基酸總類齊全，共檢測出17種常見氨基酸成分，其總含量為2.607mg/100mL。其中含有蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸等體必需的氨基酸7種（因方法原因，本文未檢測出另一種人體必需氨基酸色氨酸），非必需氨基酸10種，人體必需的氨基酸占到氨基酸總量的24.1%。其中，天冬氨酸、谷氨酸是呈鮮味的特征氨基酸，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸是呈甘味的特征氨基酸[17]，這些氨基酸的存在為雙花露純天然植物飲料的良好口感提供了一定基礎。另外，礦質元素與人體的健康有著密切的聯(lián)系，許多元素都有著重要的生理功能[18]。如鐵是人體必需的微量元素之一，它能與血紅蛋白結合，參與氧的運輸。鈉是人體中一種重要無機元素，參與水的代謝，保證體內水的平衡，調節(jié)體內水分與滲透壓，并對維持神經(jīng)、肌肉的正常功能起作用。而鉀是構成人體生理必需的化學元素，參與細胞內糖和蛋白質的代謝，與鈣、氯等離子一起維持神經(jīng)、肌肉的正常興奮性，并且還能協(xié)調正常心肌的舒張和收縮運動[19]。雙花露純天然植物飲料中檢測出了豐富的鐵、鈣、鈉、鉀等礦質元素，其中鈉和鉀元素的含量最高，分別為101.47μg/mL和119.55μg/mL。

本研究證明，雙花露純天然植物飲料中含有豐富的藥用有效成分及營養(yǎng)成分，值得進一步開發(fā)推廣。

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Component analysis of Shuang Hua botanical beverage

TANG Qing，WANG Sen-hong，LI Yan-jun，YANG Sheng，XU Xiao-yu*
（College of Pharmaceutical Sciences&College of Traditional Chinese Medicine，Southwest University，Institute of Chinese Medicine，Southwest University，Chongqing Engineering Research Center for Pharmacological Evaluation；Chongqing Engineering Research Center for Flos Lonicerae，Chongqing 400716，China）

The medicinal component and nutrient content of Shuang Hua botanical beverage was detected.RPHPLC，Ultraviolet spectrophotometer，Automatic amino acid analyzer and Atomic absorption spectrophotometry were used to detect contents of chlorogenic acid，total flavonoids，amino acids and mineral elements，respectively.The result showed that the content of chlorogenic acid in Shuang Hua botanical beverage was 301.61μg/mL，total flavonoids was 2.93mg/mL，total amino acid content was 2.607mg/100mL.The mineral content of Fe，Ca，K，Na，Mg and Zn were 2.65，4.66，119.55，101.47，11.36 and 0.52μg/mL，respectively.Shuang Hua botanical beverage contained affluent medicinal components and nutrients.It was worthy of further development and utilization.

Shuang Hua botanical beverage；chlorogenic acid；total flavonoids；amino acid；mineral element

TS275.4

A

1002-0306（2014）04-0346-05

2013－07－31 *通訊聯(lián)系人

唐清（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥物分析。

國家科技支撐計劃課題（2006BAC01A16）子課題；2013年重慶高校創(chuàng)新團隊建設計劃資助項目；秀山縣人民政府資助項目（XS20120610）。