肖 娜，佟 平，熊麗姬，3，陳紅兵，3，高金燕

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

GPC/SEC與激光光散射聯(lián)用技術(shù)在食物蛋白分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

肖 娜1，2，佟 平1，熊麗姬1，3，陳紅兵1，3，高金燕2，*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

GPC/SEC與（LLS）聯(lián)用技術(shù)在分離和測定大分子物質(zhì)的分子量及其分布中發(fā)揮著越來越重要的作用。該方法所需樣品少、快速、準(zhǔn)確，而且可以同時(shí)測定出物質(zhì)的重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）、Z均分子量（Mz）、Mw/Mn、第二維里系數(shù)（A2）以及均方根半徑（Rg）。目前GPC/SEC與激光光散射聯(lián)用技術(shù)主要用于測定蛋白質(zhì)的分子量及其分布以及研究蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)，顯示了其與眾不同的性能，而且該技術(shù)在食物蛋白中的應(yīng)用仍值得進(jìn)一步研究。

GPC/SEC，激光光散射，分子量，食物蛋白

蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，是細(xì)胞的主要成分之一。它是由L型α-氨基酸通過酰胺鍵連接而成的肽鏈，再經(jīng)過α或β折疊形成具有二級、三級、四級結(jié)構(gòu)的生物大分子物質(zhì)[1]，同時(shí)它也是人類不可缺少的食物主要構(gòu)成成分之一。當(dāng)發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)或者多肽的時(shí)候，獲得它的分子量的大小及其分子量分布，有助于對其其他方面的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究[2]。因此，構(gòu)建出一種新的方法能夠準(zhǔn)確、快速地測定出蛋白質(zhì)的分子量及其分布有著十分重要的意義。

光散射原理最早是在1972年由Wyatt[3]提出的。Wyatt指出通過光散射可以了解到散射粒子的濃度、取向、形狀及大小等情況，并且可測定出物質(zhì)的分子量。1983年Hjertberg[4]首次提出凝膠滲透色譜Gel Permeation Chromatography，GPC）低角度激光光散射聯(lián)用技術(shù)可以連續(xù)地測定多聚物的絕對分子量。物質(zhì)先通過凝膠色譜而被洗脫分離，再經(jīng)過光散射檢測器檢測出物質(zhì)的分子量，從而達(dá)到既可以分離物質(zhì)的組分，又可以準(zhǔn)確地測定出物質(zhì)的分子量的效果。因此，凝膠滲透色譜/排阻色譜（Size exclusion Chromatography，SEC）與激光光散射（Laser Light Scattering，LLS）聯(lián)用技術(shù)不僅具備了LLS技術(shù)可以測定蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)聚合物的分子量以及蛋白在不同條件下的聚合情況的優(yōu)點(diǎn)，還結(jié)合了GPC/SEC可以分離單一或混合的蛋白質(zhì)組分，同時(shí)也能得知蛋白質(zhì)純度等情況的優(yōu)點(diǎn)。而且GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正凝膠柱系，可以直接測定出物質(zhì)的分子量及其分布[5]。由于高聚物一般由不同分子量的同系物組成的混合物，因此它的分子量具有一定的分布。此外，該方法快速簡單，測定誤差一般不超過5%[6-7]。基于以上特點(diǎn)，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，例如，在食品[8]、醫(yī)學(xué)[9]、聚橡膠工業(yè)[10]等領(lǐng)域都有相關(guān)研究報(bào)道。目前多用于測定多糖、蛋白質(zhì)以及一些化學(xué)聚合物的分子量及其分布。

1 GPC/SEC-激光光散射技術(shù)原理

當(dāng)GPC儀與激光光散射儀聯(lián)用時(shí)，GPC儀可將溶液中的物質(zhì)按分子量的大小從大到小洗脫出來[11-12]。再經(jīng)過光散射檢測器進(jìn)行檢測，當(dāng)光束照射到高分子聚合物樣品時(shí)，密度起伏和溶液濃度不均一可引起光散射現(xiàn)象，除入射光外的各個(gè)方向都會(huì)產(chǎn)生散射光[13]。各個(gè)方向所收集的散射光強(qiáng)度與分子量大小及溶液濃度成正比，與散射光角度的變化、分子的尺寸大小都有關(guān)。不同角度的激光光散射儀可以從多個(gè)角度對散射光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測，這樣就提高了檢測的靈敏度，減少了誤差[14]。目前用的較多的檢測儀器是多角度激光光散射檢測儀。以18角激光光散射儀為例，收集的散射光的強(qiáng)度來自于各個(gè)方向，高分子溶液的激光散射可用以下基本公式表示[15]。

式中，K為與溶劑性質(zhì)和入射光頻率相關(guān)的常數(shù)；c為溶液濃度（g/mL）；R（θ）為不同角度去除溶劑影響后的散射光強(qiáng)度；θ為散射光角度；Mw為重均分子量；P（θ）為散射光強(qiáng)度隨角度變化的函數(shù)；A2為第二維里系數(shù)，A2是溶劑與溶質(zhì)相互作用的度量，若溶液極稀時(shí)可忽略；n0為溶劑的折射率；dn/dc為折光指數(shù)增量，指聚合物溶液折光指數(shù)相對于溶質(zhì)的濃度變化；N為阿佛加德羅常數(shù)；λ為入射光波長；Rg為高分子均方末端距，即鏈質(zhì)量中心至各個(gè)鏈段距離平方的平均值。R（θ）為儀器測定量，K、c、n0、dn/dc、N、λ、θ均為常數(shù)或已知量，其中dn/dc值可通過折光儀測定，或通過折光儀的儀器常數(shù)與輸入樣品質(zhì)量求得[16]。只有Mw、Rg和A2三個(gè)高分子鏈的基本參數(shù)為未知值，通過多個(gè)角度光散射強(qiáng)度的測定，即可推導(dǎo)求出。

隨著條件的優(yōu)化，陸續(xù)出現(xiàn)了GPC/SEC-動(dòng)態(tài)光散射檢測器（DLS）、GPC/SEC-靜態(tài)光散射檢測器（SLS）、GPC/SEC-多角度激光光散射檢測器（MALLS）、GPC/SEC-低角度激光光散射檢測器（LLLS）、GPC/ SEC-十八角激光光散射檢測器等。目前常用的主要是前三種。表1對這三種常用檢測器的特性及優(yōu)劣進(jìn)行了比較。

2 GPC/SEC-LLS在食物蛋白中的應(yīng)用

目前測定蛋白質(zhì)分子量的方法有很多，如滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠滲透色譜法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）以及質(zhì)譜法等。常用的方法有凝膠滲透色譜法和SDS-PAGE。凝膠滲透色譜法（GPC）需要知道標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量，測定出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線才能計(jì)算出待測組份的分子量的大小[17]，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的價(jià)格較高，且需要多種聯(lián)合使用，使得該方法在測定物質(zhì)的分子量方面有一定的局限性。SDS-PAGE也是常用的測定蛋白質(zhì)分子量的大小的方法之一，它還可以用于蛋白質(zhì)樣品的分離和鑒定，但是該方法測定的蛋白質(zhì)分子量的偏差較高，約在10%以上[1]，所以它對蛋白質(zhì)的分子量大小的測定也只是一個(gè)估測。而GPC/ SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)，不僅可以快速準(zhǔn)確的測定出物質(zhì)的Mw、Mn、Mw/Mn、Mz、A2以及Rg[18]，而且不需要測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定曲線?，F(xiàn)將GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)中的應(yīng)用作一概述。

表1 三種常用GPC/SEC-LLS檢測儀的比較*Table.1 The comparison of the three common GPC/SEC-LLS detector

2.1 GPC/SEC-LLS用于分離和測定蛋白質(zhì)的分子量

Ewa[19]用SEC-LLS技術(shù)檢測了14種分子量在12～475ku之間的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量，在實(shí)驗(yàn)中將蛋白質(zhì)樣品稀釋到0.1mg/mL，進(jìn)樣量50ug就能滿足儀器要求，還可以連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣。樣品先進(jìn)樣到GPC/SEC凝膠柱，再經(jīng)過示差檢測器測定出dn/dc，最后經(jīng)過紫外檢測器和光散射檢測器檢測，使用ASTRA軟件對所得的峰進(jìn)行分析，結(jié)果表明，對于分子量大于40ku的蛋白質(zhì)，其誤差范圍都在5%以內(nèi)，而且該方法快速、簡單。Yan[20]用陰離子交換柱、SDS-PAGE和GPCMALLS這三種技術(shù)聯(lián)合使用測定不同的大豆中大豆球蛋白及其亞群的差異。Emmanuelle[21]用GPC-LLS聯(lián)用技術(shù)測定含有半光氨酸的蛋白質(zhì)與聚已二酸乙二醇酯發(fā)生可逆加成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后所得到的復(fù)合物的分子量的大小，從而判斷出二者的結(jié)合狀態(tài)。此外，該技術(shù)不僅用于測定蛋白質(zhì)的分子量，也常用于測定多糖、多糖衍生物以及一些化學(xué)聚合物的分子量及其分布。Raymond[22]用SEC-MALLS技術(shù)測定多種不同的溶劑中的醋酸琥珀羥丙甲纖維素（HPMCAS）的分子量及其分布，所測定的分子量的誤差范圍在3%～6%以內(nèi)。由此可見，無論測定蛋白質(zhì)和多糖，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)都可以簡單而直接地測定出其分子量及其分布，而且該方法快速，準(zhǔn)確。所以GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)對于測定物質(zhì)的分子量及其分布的優(yōu)勢很明顯。

2.2 GPC/SEC-LLS用于檢測蛋白質(zhì)的純度、分析蛋白質(zhì)聚合物的狀態(tài)

Qiang等[23]用SEC-DLS技術(shù)研究了擠壓過程中不同的機(jī)械剪切力對大豆蛋白聚合物的影響，為大豆在擠壓過程中的聚合情況的變化提供了有力的依據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)大豆在擠壓過程中隨著擠壓剪切力的加大，大豆蛋白的分子量會(huì)加大，說明大豆蛋白發(fā)生了聚合；然而，當(dāng)擠壓力度加大到一定程度之后，大豆蛋白的分子量減小，說明大豆蛋白發(fā)生了解聚。Yang[24]同時(shí)使用GPC-MALLS、zeta-電位法以及等溫滴定量熱法這三種方法研究β-乳球蛋白和甜菜果膠在不同的pH的情況下所形成的絡(luò)合物的聚合情況以及結(jié)構(gòu)的變化，并繪制出其結(jié)構(gòu)變化曲線圖。Yasushi[25]通過該方法測定了OmpF孔蛋白分子量及其分布，從而掌握了該蛋白的重疊和重組的情況。Matsumura[26]使用GPC-MALLS聯(lián)用技術(shù)分別測定了在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和茂原鏈輪絲菌的催化作用下α-乳白蛋白交聯(lián)形成的聚合物大小的情況。Matsumura指出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和茂原鏈輪絲菌都能夠很快的催化α-乳白蛋白交聯(lián)，通過測定α-乳白蛋白的分子量及其分布的變化可表征出α-乳白蛋白的單體快速的減少，以及大型聚合物的快速增長；而且茂原鏈輪絲菌所催化的α-乳白蛋白所形成的聚合物粒子的大小及其分子量都要比轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶所催化形成的聚合物粒子及其分子量要大，從而說明茂原鏈輪絲菌的催化作用要比轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化作用要強(qiáng)；然而，在含有Ca2+存在的情況下，Ca2+會(huì)抑制α-乳白蛋白的交聯(lián)，所形成的聚合物分子量也更小。不僅如此，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)還可以從待測蛋白的出峰情況判斷出待測蛋白的純度，純蛋白只會(huì)有一個(gè)峰，而雜蛋白則會(huì)有多個(gè)的峰值[27-28]。顯然，使用GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)不僅可以測定蛋白質(zhì)的純度還可以判斷出蛋白質(zhì)在不同條件下的的聚合狀態(tài)，從而可以判斷出蛋白質(zhì)的聚合是受哪些條件的影響。不言而喻，GPC/SECLLS聯(lián)用技術(shù)是測定蛋白質(zhì)純度及聚合物的聚合情況的良好工具。

2.3 GPC/SEC-LLS用于研究不同條件對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

Beaulieua等[29]用SEC-MALLS聯(lián)用技術(shù)測定果膠對加熱之后乳清蛋白的聚合的影響。在沒有鈣的情況下，果膠對乳清蛋白在加熱時(shí)所形成的的聚合物的分子量大小及其分布沒有太大影響；而在有鈣的情況下，低甲氧基果膠會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白加熱時(shí)形成的聚合物的分子量變小，峰型也變小，分子量分布變窄，說明低甲氧基果膠會(huì)抑制加熱時(shí)乳清蛋白的聚合。Mallika[30]應(yīng)用GPC-DLS聯(lián)用技術(shù)方法測定了GPC純化的β-乳球蛋白的分子量及其分布，通過測定不同溫度下處理β-乳球蛋白其分子量及其分布的變化，發(fā)現(xiàn)25℃時(shí)β-乳球蛋白以單體的形式存在；溫度升到30℃的時(shí)候，β-乳球蛋白則同時(shí)以單體和二聚體的形式存在；溫度再升高到45℃或更高時(shí)，β-乳球蛋白則會(huì)部分變性。眾所周知，蛋白質(zhì)具有多種性質(zhì)和作用，如起泡性、溶解性、具有黏度、凝膠作用、乳化作用等，而且它也很容易受外界條件的影響，如pH、溫度、表面活性劑等，因而，探索某一條件對蛋白質(zhì)的性質(zhì)的影響有重要意義。通過GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量及其分布，可以得知某一因素對蛋白質(zhì)的分子量及其性質(zhì)的影響有多大[31-32]，從而可以推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分子量的變化的關(guān)系。由此可見，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)在食品研究與應(yīng)用方面具有重要價(jià)值。

3 結(jié)論與展望

在進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析中，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)能夠高效、快速、準(zhǔn)確地測定出大分子物質(zhì)的分子量及其分布、分散性、聚合情況等。然而，GPC/SECLLS聯(lián)用技術(shù)只是單一的通過測定物質(zhì)的分子量及其分布來反映物質(zhì)的一些特性。如果能將其和其他儀器聯(lián)合使用，如和黏度檢測器連用，則不僅可以測定物質(zhì)的分子量，還可以測定物質(zhì)的黏度，這樣，就為分子量的大小與黏度的關(guān)系提供更加有利的依據(jù)。國外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)與黏度檢測器聯(lián)用[33-34]，國內(nèi)則未見有相關(guān)的報(bào)道。而且目前國內(nèi)應(yīng)用GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)測定食物蛋白質(zhì)的分子量及其的分子量分布、聚合情況等的相關(guān)應(yīng)用也并不多見。隨著技術(shù)的發(fā)展及需要，GPC/SEC-LLS聯(lián)用技術(shù)將會(huì)在測定食物蛋白質(zhì)純度、分子量及其分子量的分布、聚合程度等研究領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用。

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Application of GPC/SEC coupled with laser light scattering on food proteins

XIAO Na1，2，TONG Ping1，XIONG Li-ji1，3，CHEN Hong-bing1，3，GAO Jin-yan2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.College of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China；3.Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

GPC/SEC and laser light scattering（LLS）combined technology play a more and more important role in the separation determination of molecular weight and its distribution of macromolecular substances.This method requires less samples，and also was fast and accurate，moreover it could also determine average molecular weight（Mw），the number average molecular weight（Mn），Z-average molecular weight（Mz），Mw/Mn，the second virial coefficient（A2）and root mean square radius（Rg）of the material.GPC/SEC and laser light scattering detection application in protein was summarized.At present，the technology mainly used for the determination of protein molecular weight and its distribution as well as the study of protein aggregation state，and showed its distinctive performance，however，its application in food protein deserved further study.

GPC/SEC；laser light scattering；molecular weight；food proteins

TS203

A

1002-0306（2014）04-0384-04

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

肖娜（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2013AA102205）；國家國際科技合作專項(xiàng)（2013DFG31380）；國家自然科學(xué)基金（21162019）；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20122BBG70170-2）。