任廣明，郭 興，陳志新

（1.黑龍江省伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化香菇多糖鐵（Ⅲ）配合工藝研究

任廣明1，2，郭 興1，陳志新1

（1.黑龍江省伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

在單因素基礎(chǔ)上，以鐵結(jié)合率為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken Design設(shè)計原理，分析香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH和溫度對香菇多糖鐵（Ⅲ）結(jié)合率的影響，建立相應(yīng)的預(yù)測模型。最佳優(yōu)化工藝為香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比為1.8，pH為8.0，溫度為68.7℃，鐵結(jié)合率為11.69%。驗證結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法所優(yōu)化出的配合工藝合理、有效、具有可行性。

香菇多糖，香菇多糖鐵（Ⅲ），響應(yīng)曲面法

鐵是人體內(nèi)必需的微量元素之一，由于鐵缺乏引起的缺鐵性貧血（IDA）已經(jīng)成為世界上最常見營養(yǎng)性疾病之一，威脅著人類的健康[1]。臨床上一直選用硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵等無機鐵和小分子有機酸鐵鹽作為補鐵劑，其二價鐵離子易產(chǎn)生內(nèi)源性自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化進而造成機體損傷[2]，具有明顯的副作用。

香菇多糖（lentinan，LNT）是香菇中主要的生物活性成分，具有廣泛的藥理活性，如抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)免疫功能，并能增強體液免疫和細(xì)胞免疫功能，降血脂和抗衰老等作用[3-5]。香菇多糖與其他抗腫瘤、抗病毒的藥物相比，具有療效高、毒副作用小等優(yōu)點。香菇多糖與鐵配合生成多糖鐵配合物（Polysaccharide-Iron Complex，PIC）已經(jīng)成為研究的熱點，是目前可以應(yīng)用于臨床中的一種較強的免疫增強劑[6]。當(dāng)配合物釋放鐵的同時，配體多糖的生物活性成分也可被機體吸收，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)?？梢姡嗵氰F配合物將成為一種具有廣闊發(fā)展空間的補鐵劑。

響應(yīng)曲面法是一種多元分析方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域的物質(zhì)配比、工藝條件等優(yōu)化研究[7-12]，該方法能夠建立連續(xù)變量曲面模型，針對影響效應(yīng)值的各因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價[13]。本研究以鐵結(jié)合率為評價指標(biāo)，分析了香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH、時間和溫度對香菇粗多糖鐵（Ⅲ）配合效率的影響。采用Box-Behnken設(shè)計，設(shè)計17組配合實驗，建立連續(xù)變量曲面模型。通過數(shù)據(jù)分析確定了香菇多糖鐵（Ⅲ）最佳配合工藝，為香菇多糖及補鐵劑的開發(fā)與利用提供了相關(guān)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9608香菇菌株 由黑龍江省伊春林業(yè)科學(xué)院保藏；葡萄糖、氫氧化鈉、三氯化鐵、無水乙醇、丙酮、碳酸鈉、檸檬酸三鈉、氯仿、正丁醇、鹽酸、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等 均為分析純；鐵標(biāo)準(zhǔn)液1000mg/L，北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司。

BAO-35A精密鼓風(fēng)干燥箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠；HZ-2111KB立式振蕩培養(yǎng)箱 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AA-6800原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 香菇多糖的制備

將香菇菌株接種于CYM培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。通過搖床培養(yǎng)獲得大量香菇菌絲體，過濾后于60℃恒溫干燥箱中烘干。將烘干后的香菇菌絲體用適量的水置于85℃水浴鍋中浸提5h，調(diào)節(jié)提取液的pH為7.0，離心得上清液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮上清液后，量取3倍體積的75%乙醇溶液沉淀濃縮液中的多糖，4℃靜置過夜后傾去醇沉多糖的上清液，3000r/min離心10min后分級沉淀法純化粗香菇多糖，真空干燥[14-15]。將干燥的香菇多糖粗品溶于水，扎袋流水透析除鹽后，透析液減壓濃縮，醇析、離心、真空干燥后得精制香菇多糖。采用硫酸蒽酮比色法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)液測定香菇多糖的糖含量[16]。

式中：m1為真空干燥后香菇多糖量，g；m2為食用菌菌絲體的干重，g。

1.3 香菇多糖鐵(Ⅲ)配合實驗

稱取一定質(zhì)量比的香菇多糖與檸檬酸三鈉，將其溶于50mL去離子水中，在恒溫水浴中不斷攪拌10min，緩慢均勻滴加2mol/L FeCl3溶液和20%的NaOH溶液?？刂品磻?yīng)液的pH。反應(yīng)中剛滴入的FeCl3溶液開始形成沉淀，隨后沉淀逐漸溶解，當(dāng)反應(yīng)中產(chǎn)生的沉淀不再溶解時，表明反應(yīng)系統(tǒng)的絡(luò)合能力達(dá)到飽和，停止滴加FeCl3溶液和NaOH溶液。繼續(xù)在恒溫水浴中攪拌2.0h，反應(yīng)冷卻后離心、醇析、醇沉，真空干燥。將干燥后的香菇多糖鐵(Ⅲ)粗品溶于水中，扎袋流水透析除鹽，最終制得香菇多糖鐵（Ⅲ）（lentinan-Iron（Ⅲ）complex）配合物[17-19]。

1.4 香菇多糖鐵(Ⅲ)配合物的單因素實驗

針對香菇多糖鐵(Ⅲ)配合物制備設(shè)計單因素試驗，使香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比分別為0、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0，恒溫水浴溫度水平為40、50、60、70、80、90℃，反應(yīng)液的pH分別控制在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)的絡(luò)合能力達(dá)到飽和后恒溫水浴攪拌時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，其中試驗固定因子水平：香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比1.0、恒溫水浴溫度60℃，pH7.0，攪拌時間為2h。

1.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化實驗

根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）組合設(shè)計原理，選取香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH和溫度3個因素作為自變量，香菇多糖鐵結(jié)合率（R）為響應(yīng)值，設(shè)計了三因素三水平共17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，其因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計編碼及水平表Table.1 Codes and Levels of RSM

1.6 香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物中鐵含量測定

鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：將鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成濃度為1、2、3、4、5mg·L-1的鐵溶液，通過原子吸收分光光度計的測定后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線校正儀器誤差。

準(zhǔn)確稱取100mg香菇多糖鐵（Ⅲ），加入10mL混合酸（HNO3∶HClO4，4∶1）置于電熱板上（130℃）加熱消化，消化液變成無色透明后，加水反復(fù)趕酸，冷卻后蒸餾水定容至25mL量瓶中原子吸收分光光度法測定Fe3+濃度[19]。原子吸收分光光度計法測定參數(shù)：燈電流6.0mA，狹縫寬0.5nm，波長248.3nm，燃燒器高度6mm，空氣流量6.5L/min，乙炔流量1.5L/min。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計分析軟件Design Expert V8對BBD設(shè)計實驗的結(jié)果進行分析，擬合二次多項式方程并繪制響應(yīng)曲面圖，并確立香菇多糖鐵（Ⅲ）最佳配制工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇多糖含量的測定

9608香菇菌株接種于300mL CYM培養(yǎng)基中，獲得干菌絲體2.04g，熱水煮沸法提取香菇多糖，香菇多糖經(jīng)分級沉淀法純化透析后得精多糖0.36g，提取率為17%。采用蒽酮硫酸法測定香菇多糖中的可溶性多糖的含量，620nm波長下紫外分光光度計檢測。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.7534X+0.0432（R2= 0.9933），通過計算得該品種可溶性總多糖含量為39.92%。

2.2 香菇多糖鐵（Ⅲ）配合的單因素實驗

2.2.1 香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比對鐵結(jié)合率的影響 在香菇多糖鐵（Ⅲ）配合反應(yīng)中，F(xiàn)e3+首先通過O橋或O-H橋聚合形成聚合鐵核，聚合鐵核微粒表面可以結(jié)合香菇多糖從而形成絡(luò)合物[20-21]。Spiro和Saltman認(rèn)為將檸檬酸鹽添加到pH高于4時的反應(yīng)溶液中，檸檬酸鹽有助于Fe3+聚合形成聚合鐵核，進而使聚合鐵核微粒表面結(jié)合親水性配體，產(chǎn)生“增溶”的效應(yīng)[22]。香菇多糖分子含有羥基、羧基、烷基等親核能力較強的供電子基團，易與金屬離子配合，當(dāng)香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比不斷增大時，在檸檬酸三鈉的催化下這些供電子基團的金屬離子結(jié)合位點逐漸達(dá)到飽和，即隨著香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比的增大鐵結(jié)合率不斷增大，當(dāng)質(zhì)量比為大于1.5后開始下降。從圖1中可以看出，香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比為1.5時鐵結(jié)合率最高為10.57%。

圖1 香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比對鐵結(jié)合率的影響Fig.1 Effect of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate on the rate of iron combination

2.2.2 反應(yīng)液pH對鐵結(jié)合率的影響 由于檸檬酸三鈉在pH高于4時發(fā)揮其催化作用，因此實驗設(shè)計的pH依次為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。從圖2中可以看出，鐵結(jié)合率隨著pH的升高而增大。反應(yīng)液pH4.0時鐵結(jié)合率為5.92%，當(dāng)pH增大到8.0時鐵結(jié)合率為10.63%，反應(yīng)液pH9.0時鐵結(jié)合率降低了0.2%。從圖2中可知，香菇多糖配合鐵實驗中pH過大，反應(yīng)液中離子強度增強，產(chǎn)生的陰離子與多糖分子的活性基團發(fā)生競爭作用進而阻礙配合物的形成，當(dāng)pH偏低時，反應(yīng)液中生成的氫離子增多，導(dǎo)致鐵離子配合不完全。糖分子中C2、C3、C6位上的-OH均具有較強的反應(yīng)活性，是鐵（Ⅲ）配合的主要位點，易受反應(yīng)液中pH的影響，進而影響了鐵的配合效率[23]。從圖2可以看出，香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物反應(yīng)液最佳pH為8.0，與石德成[23]、馬瑩[24]等研究結(jié)果一致。

圖2pH對鐵結(jié)合率的影響Fig.2 Effect of pH on the rate of iron combination

2.2.3 時間對鐵結(jié)合率的影響 從圖3可以看出，配合反應(yīng)時間在0.5～2.5h時，鐵結(jié)合率不斷增大，在1.0～2.5h時，鐵結(jié)合率雖有增加，但其增長幅度較小。當(dāng)配合反應(yīng)時間為1.0、1.5、2.0h時其鐵結(jié)合率分別為11.13%、11.16%、11.23%，在反應(yīng)時間為2.5h時鐵結(jié)合率達(dá)到最大值11.27%，當(dāng)反應(yīng)時間延長至3.0h時，其鐵結(jié)合率小幅度降低，這可能由于當(dāng)香菇多糖鐵（Ⅲ）配合完全后繼續(xù)水浴攪拌易使配合物發(fā)生解離反應(yīng)，繼而導(dǎo)致鐵結(jié)合率降低。從圖3中可知，香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物中鐵結(jié)合率隨著時間的延長先增高后降低。

圖3 時間對鐵結(jié)合率的影響Fig.3 Effect of time on the rate of iron combination

2.2.4 溫度對鐵結(jié)合率的影響 從圖4可知，鐵結(jié)合率在溫度為40、50、60℃時隨著溫度的升高而增大，溫度為60℃時鐵結(jié)合率最大為11.4%，反應(yīng)液溫度由60℃升高到90℃時鐵結(jié)合率逐漸降低并趨于平緩。這可能是由于反應(yīng)液溫度過高時，溶液中的分子運動增強，離子振動劇烈，不利于多糖配體與聚合鐵核間接觸發(fā)生配合。從圖4中可以看出，香菇多糖鐵（Ⅲ）最佳配合溫度為60℃。

圖4 溫度對鐵結(jié)合率的影響Fig.4 Effect of temperature on the rate of iron combination

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化實驗

2.3.1 回歸模型的建立及數(shù)據(jù)分析 根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）組合設(shè)計原理，選取香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH和溫度3個因素作為自變量，鐵結(jié)合率（R）為響應(yīng)值，設(shè)計了17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表2。

利用Design Expert V 8軟件對表2中實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，從表3中可以看出，數(shù)據(jù)分析后所建立的模型回歸極顯著（p＜0.01），該方程的一次項A、B和交互項AB極顯著（p＜0.01），說明香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH是優(yōu)化實驗中對鐵結(jié)合率影響最顯著的因素。從表3中可知，方程的二次項A2、B2、C2表現(xiàn)也為極顯著（p＜0.01）。

通過對數(shù)據(jù)進行多元擬合分析獲得響應(yīng)值R對自變量的多項回歸方程：R=-46.82+11.58A+0.89B+ 1.24C+1.46AB-6.49A2-0.14B2（方程中項系數(shù)極小時忽略此項）。該模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9896，調(diào)整R2＝0.9762，說明該模型擬合程度較好，可用來分析和預(yù)測香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物合成工藝。

表2 Box-Behnken Design變量值及響應(yīng)值Table.2 Values of variables and responses in Box-Behnken design

表3 多元方程方差分析表Table.3 ANOVA for the quadratic equation

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 圖5～圖7給出了香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH和溫度3因素之一取零水平時其他2因素對于響應(yīng)值R的影響。通過對響應(yīng)曲面圖5觀察發(fā)現(xiàn)：香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比較低，pH較小時，鐵結(jié)合率較低。隨著香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH的增加鐵結(jié)合率不斷增大。香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比在一定范圍內(nèi)時，增大反應(yīng)液中的pH將有助于提高鐵結(jié)合率。從圖6中可知，在pH6.0時，隨著香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比的增加，鐵結(jié)合率先增大后減小，這是由于隨著時間不斷增加使香菇多糖與鐵（Ⅲ）逐漸絡(luò)合從而增加了鐵結(jié)合率，當(dāng)多糖分子中鐵結(jié)合位點與鐵絡(luò)合完全后隨著時間的增加又發(fā)生了解離反應(yīng)，導(dǎo)致鐵結(jié)合率降低。圖7表明，在香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比為1.5時，反應(yīng)液的pH與溫度對鐵結(jié)合率的影響比較來看，pH對鐵結(jié)合率較顯著?？梢?，3種因素對鐵結(jié)合率及響應(yīng)值R影響均不是簡單的線性關(guān)系，因素之間的交互作用也起到重要的作用。

圖5 香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、pH及其交互作用對鐵結(jié)合率的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate，pH and their interaction on the rate of iron combination

圖6 香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比、溫度及其交互作用對鐵結(jié)合率的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of the mass ratio between Lentinan and catalyst sodium citrate，temperature and their interaction on the rate of iron combination

圖7 PH、溫度及其交互作用對鐵結(jié)合率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of pH，temperature and their interaction on the rate of iron combination

2.3.3 最佳配合實驗及驗證 通過對數(shù)據(jù)的處理分析，在香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比為1.8，pH為8.0，溫度為68.7℃條件下，R的最大預(yù)測值為12.53%。在以上條件下做5次驗證實驗，鐵結(jié)合率的平均值11.69%。預(yù)測值與實際值接近，說明該回歸模型所優(yōu)化出的配合工藝是合適有效的。因此，響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物的合成工藝可以用來指導(dǎo)實際生產(chǎn)。

3 結(jié)論與討論

實驗通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化出香菇多糖鐵（Ⅲ）配合物合成工藝：香菇多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量比為1.8，pH為8.0，溫度為68.7℃。實驗中鐵結(jié)合率預(yù)測值為12.53%，通過驗證結(jié)果（11.69%）表明，優(yōu)化出的配比工藝條件合理、有效，具有可行性。

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Optimization of synthesis of lentinan-Iron（Ⅲ）complex by response surface methodology

REN Guang-ming1，2，GUO Xing1，CHEN Zhi-xin1
（1.College of Forestryource and Science，Yichun 153000，China；2.College of Resource and Environmental science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Based on the single factor tests，the effects of mass ratio between lentinan and catalyst sodium citrate，pH reaction temperature on iron combination rate of lentinan-Fe（Ⅲ）were designed using Box-Behnken to assess the combination rate of iron（Ⅲ）.A prediction model was established.The optimal synthesis conditions were mass ratio between lentinan and catalyst sodium citrate of 1.8，pH8.0，reaction temperature of 68.70℃，iron combination rate of lentinan-Fe（Ⅲ）was 11.69%.It was generally accepted that the response surface method was scientific and optimum for the synthesis of lentinan-Iron（Ⅲ）complex.

lentinan；lentinan-Iron（Ⅲ）complex；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）04-0251-05

2013－05－13

任廣明（1984-），女，博士研究生，研究方面：微生物學(xué)。

黑龍江省森林工業(yè)總局項目（sgzjY2011020）。