周中凱，陳曉姍，張 巖，鄭排云，楊 艷

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

淀粉結構調控大腸微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的機制研究

周中凱，陳曉姍，張 巖，鄭排云，楊 艷

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

通過對普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉的不同處理，得到系列不同結構的淀粉底物，進而分別測定它們在發(fā)酵進程中產(chǎn)丁酸的能力。經(jīng)淀粉的結構特征與腸道微生物合成丁酸的關系的進一步研究，結果顯示高直鏈玉米淀粉及其熱處理的樣品屬于緩速發(fā)酵型底物，發(fā)酵后其產(chǎn)丁酸的濃度高達19.77～27.72mmol/L；而玉米淀粉及其熱處理的樣品屬于快速發(fā)酵型底物，發(fā)酵后更易產(chǎn)生高濃度的醋酸和乳酸，而丁酸的濃度僅為2.48～14.19mmol/L，熱處理會大幅度降低該類底物合成丁酸的能力，表明淀粉底物結構與腸道合成丁酸的能力密切相關。

淀粉結構，微生物發(fā)酵，短鏈脂肪酸，丁酸

丁酸是由結腸共生菌發(fā)酵食物纖維和抗性淀粉產(chǎn)生的一種短鏈脂肪酸，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，丁酸可預防大腸癌的發(fā)生[1]。據(jù)報道，在世界范圍內，大腸癌的發(fā)病率位居腫瘤第二位，大腸癌占男性全部惡性腫瘤發(fā)病的9.4%，女性10.1%。全球每年大約102萬新發(fā)病例，53萬死亡病例，其中我國每年新發(fā)病人數(shù)約40萬人，死亡為7.35～10萬。大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國所有腫瘤發(fā)病率中排名第5位，而且其具有明顯的上升趨勢。有關的醫(yī)學研究表明在大腸癌患者的大腸中，丁酸含量比正常人大腸中的丁酸含量低許多[2]。除此之外國內外還有報道稱丁酸可抑制前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、白血病等多種腫瘤細胞的生長，促進其分化，并誘導細胞凋亡，抑制腫瘤的侵襲和浸潤[3-4]。盡管其作用的分子機制目前尚未完全闡明，但丁酸作為一種有效的防癌、抗癌因子則已被證實[5-6]。淀粉特別是抗性淀粉可經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生丁酸，有關研究表明抗性淀粉產(chǎn)丁酸能力超過其他膳食纖維[1]，但是不同來源的淀粉產(chǎn)丁酸能力差異很大，這取決于淀粉的精細結構[7-8]。淀粉是如何調節(jié)微生物的代謝途徑進而影響腸道合成丁酸能力的機理目前仍然不是十分清楚。本文以不同結構的淀粉為原料，模擬人體腸道發(fā)酵模型，使淀粉經(jīng)體外代謝來研究淀粉結構如何調節(jié)微生物代謝途徑。本研究之所以以淀粉為原料基于下面幾點考慮：一是以相同量的底物來進行微生物的發(fā)酵，可消除因底物的量的差異影響到丁酸的產(chǎn)量；二是因為抗性淀粉是由四種類型組成，第一種類型是因食品的質構因素阻礙了其與消化酶接觸從而進入大腸，這部分抗性淀粉的結構與原淀粉沒有非常大的差別；三是通過調整制備工藝可以獲得系列結構不同的淀粉底物，從而可拉大淀粉底物結構對發(fā)酵過程的敏感性，即放大底物結構對微生物代謝途徑的影響。這個模型可以使我們更清楚地了解底物結構是如何調控微生物的代謝狀況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通玉米淀粉 美國Sigma公司；高直鏈玉米淀粉 澳大利亞國民淀粉公司。

BAO-50A型干燥箱 美國STIK GROUP LLC公司；EC1X2型高壓鍋 美國CA，ASC Process Systems公司；SM-6610型掃描電子顯微鏡 日本Tokyo，JEOL公司；Excalibur 3100型紅外光譜儀 Varian；PIKE technologies型數(shù)顯高壓鉗 美國PIKE；Agilent 7890A型氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Allegra X-12型離心機 美國Beckman Coulter公司。

1.2 實驗方法

本實驗采用兩種熱處理方式改變淀粉的結構：一是無水條件下的熱處理；二是在含水條件下進行高壓蒸煮的處理。

1.2.1 無水條件下熱處理 將淀粉先在50℃干燥箱中脫水（總約12h），然后將烘箱的溫度升至135～140℃并維持3.0h，將樣品取出，冷卻，密封，備用。

1.2.2 含水條件下進行高壓蒸煮處理 將淀粉用蒸餾水分別調至成含25%和60%的水分，然后進入高壓鍋中加熱（121℃，20min），然后冷卻至室溫此為一個加熱循環(huán)。根據(jù)加熱循環(huán)次數(shù)不同可制備出一系列淀粉樣品。蒸煮后樣品冷卻，冷凍干燥，粉碎，然后過0.5mm篩網(wǎng)，最后將樣品密封待用。將經(jīng)上述處理所得的樣品進行編號，詳見表1。

表1 實驗用淀粉底物處理方式及樣品編號Table.1 Method for processing starch substrate and sample No.

1.2.3 利用FTIR分析淀粉的組織結構 淀粉樣品的結構采用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析，采用DTGS檢測器，利用MIRacleTM全反射衰減晶片和數(shù)顯高壓鉗完成測定。樣品直接加載到晶片上并在3600～600cm-1范圍內掃描，分辨率為4cm-1。記錄之前光譜以空白為背景進行轉變校正，利用Varian Resolutions Pro軟件進行基線修定，并處理得到圖譜[9-10]。

1.2.4 微生物發(fā)酵 利用微生物發(fā)酵法分別降解各淀粉樣品，對其降解前后的分子結構進行分析。微生物發(fā)酵法的生物模型主要是模擬人體大腸發(fā)酵體系，即利用人體腸道微生物菌群的體外培養(yǎng)來研究淀粉的發(fā)酵過程[11]。

實驗操作過程為：采用磷酸緩沖液將來源于健康人體糞便制備成10%（w/v）的腸道微生物混合菌液，用于體系發(fā)酵。取200mg淀粉樣品底物加入到含9mL發(fā)酵介質的發(fā)酵瓶中并水合1h（溫度控制在4℃）。發(fā)酵介質包含以下物質（每1L蒸餾水）：2.5g胰蛋白酶、125μL礦物質溶液（每升蒸餾水中132g CaCl2·2H2O，100g MnCl2·4H2O，10g CoCl2·6H2O，80g FeCl3·6H2O）、250mL緩沖溶液（每升蒸餾水中4g（NH4）HCO3、35g NaHCO3）、250mL礦物質溶液（每升蒸餾水中5.7g Na2HPO4，0.6g MgSO4·7H2O）和1.25mL刃天青溶液0.1%（w/v）。取33.5mL滅菌后的還原性溶液（每升蒸餾水中6.25g半胱氨酸鹽酸鹽，6.25g Na2S·9H2O，40mL NaOH）添加到1L發(fā)酵介質中，發(fā)酵介質的pH調整到7.2。每個發(fā)酵瓶接種1mL的微生物混合菌液，混合菌液中含有1×1010cfu/mL活菌，最終保證達到每個發(fā)酵瓶中含有1×109cfu/mL活菌。每個實驗瓶中用氮氣噴霧，并用石蠟密封作為防止泄露的預防措施。實驗瓶在37℃振蕩中培養(yǎng)24h，發(fā)酵結束后立即冷凍貯藏。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸和乳酸的分析 取上述2mL發(fā)酵液離心，取1mL清液與50μL的0.1mmol/L的二乙基乙酸混合作為內標物，同時添加500μL的濃HCl和2mL乙醚溶液進行提取。振蕩處理1min，離心，取乙醚層，再乙醚提取，合并乙醚層。將100μL的三氟乙酰胺添加到乙醚提取溶劑中。將混合體系加熱到80℃并維持20min，經(jīng)反應形成叔丁基二甲硅烷基衍生物。用氣相色譜儀（CG）對衍生物進行分析，毛細管柱（30m×0.25μm）的薄膜厚度為0.1μm，進樣系統(tǒng)和檢測器的溫度為275℃，色譜柱的溫度調控在63℃保留3min，然后以每秒10℃升溫到190℃。以氮氣為載氣，進樣量為0.2μL。

1.2.6 掃描電子顯微鏡（SEM）觀測淀粉的形態(tài) 按表1處理得到的淀粉樣品冷凍干燥、輕微粉碎后，均勻地撒在貼有雙面膠的樣品面盤上，用Hitachi 1B-3離子涂布器噴金固定，然后利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察并記錄顆粒形態(tài)。未經(jīng)處理的淀粉樣品用SEM直接觀察并與前者進行比較。對每種淀粉樣品至少記錄三次其顆粒形態(tài)[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在農(nóng)村經(jīng)濟管理工作中運用信息化手段，還需要進一步加強網(wǎng)絡安全管理，保障網(wǎng)絡系統(tǒng)始終處于正常的運行狀態(tài)，為財務信息提供安全保障。與此同時，網(wǎng)絡信息系統(tǒng)采用模塊化的組合方式，既可以滿足不同客戶的需求，又能避免出現(xiàn)不當?shù)耐顿Y行為[5]。

每個樣品進行4次平行測定，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS 11.5 for windows統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 淀粉結構的比較

2.1.1 熱處理對淀粉顆粒外形的影響 干熱處理對淀粉顆粒形態(tài)的影響取決于淀粉的來源。在干熱處理條件下，兩種來源的淀粉顆?？傮w形態(tài)沒有發(fā)生變化，但對于普通玉米淀粉而言，其表面產(chǎn)生微小細孔，可能是因為這種熱處理破壞了淀粉內部結構或者是原來淀粉顆粒本身具有微小細孔，并在處理過程中其變得更為明顯；對于高直鏈玉米淀粉而言，干熱處理后，其整個形態(tài)及表面沒有發(fā)生明顯變化。

濕熱處理導致淀粉顆粒原來的形貌完全喪失，這是因為在高壓高溫條件下兩種淀粉顆粒均遭到破壞，相互粘結，形成不規(guī)則形態(tài)。雖然兩者均為不規(guī)則型，但從局部特征來看，在斷裂面的精細結構上濕熱處理后的普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉呈現(xiàn)出不同的特征（圖1），普通玉米淀粉顆粒的斷裂面呈現(xiàn)出了表面疏松易斷裂的結構特征，且表面比較粗糙；而對于高直鏈玉米淀粉顆粒，其斷裂面比較圓整且相對光滑。

圖1 濕熱處理后破裂淀粉顆粒表面結構圖（7500×）Fig.1 The surface structure of collapsed starch granules after moistured thermal treatment（7500×）

2.1.2 不同淀粉樣品的FTIR圖譜 熱處理破壞了淀粉顆粒內部原有的分子有序結構，從而形成新的結構特征，這種處理前后的結構變化可用傅里葉變換紅外光譜來描述。干熱處理對兩種淀粉的總體光譜圖譜特征吸收峰的分布影響不顯著，而濕熱處理對不同淀粉而言，其光譜圖譜的變化幅度則大不相同（圖2）。

圖2 不同熱處理對淀粉傅里葉變換紅外光譜圖的影響Fig.2 The effect of different thermal treatment on starch FTIR spectrum

對于普通淀粉而言，濕熱處理后其圖譜發(fā)生了顯著的變化，通過分析其譜圖特征吸收峰發(fā)現(xiàn)，濕熱處理之后其在1047cm-1處的吸收峰的強度較處理前有所降低，而在1022cm-1處的吸收峰較處理前有所增加。一般認為在1047cm-1的吸收峰是由兩個重疊的峰組成，分別為1040cm-1和1053cm-1。在淀粉分子的重新排序過程中，在1040cm-1處波峰出現(xiàn)極快，而在1053cm-1處波峰的形成需要較長的時間。該吸收峰表示淀粉結構變得更為有序，而1022cm-1處波強表明淀粉分子為無序排列的狀況。因此，在1047cm-1和1022cm-1處的吸收度分別與淀粉的有序和無序的結構有關。另外濕熱處理顯著性地改變普通玉米淀粉的譜圖特征，特別是在兩個高吸收峰處（1022cm-1和1000cm-1）峰形由左低右高變化為左高右低，增大了玉米淀粉對水分子的敏感度，這些綜合的結構特征也將會大大影響到淀粉的自身代謝性質[12]。

而對高直鏈玉米淀粉而言，濕熱處理雖然對1047cm-1處吸收峰的影響不大，但是在1022cm-1處的吸收峰有明顯降低，其在1000cm-1左右的吸收峰沒有發(fā)生明顯遷移，說明高直鏈玉米淀粉的抗蒸煮性很強，這可能與其內部高度有序的結構有關。

2.2 淀粉結構對微生物發(fā)酵產(chǎn)物的影響

2.2.2 不同淀粉結構對發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度的影響

2.2.2.1 兩種原淀粉間的比較 普通玉米淀粉產(chǎn)生的總短鏈脂肪酸的濃度高于高直鏈玉米淀粉。但是如果分析每種短鏈脂肪酸的含量就會發(fā)現(xiàn)，普通玉米淀粉發(fā)酵過程更傾向于產(chǎn)生大量的乙酸，同時丙酸的產(chǎn)量也非常高，然而對于在腸道中生理活性最高的丁酸而言，普通玉米淀粉在發(fā)酵過程中對其合成的能力遠低于高直鏈玉米淀粉。

2.2.2.2 干熱處理對各自淀粉產(chǎn)酸能力的影響 干熱處理后，對高直鏈玉米淀粉，其發(fā)酵生產(chǎn)短鏈脂肪酸能力有所提高，這主要是體現(xiàn)在對三種短鏈脂肪酸的產(chǎn)量均有提升，特別是對丁酸的合成能力的提升最為明顯。而普通玉米淀粉經(jīng)過干熱處理后，雖然其發(fā)酵液中乳酸的濃度有所上升，但各個短鏈脂肪酸的濃度均有不同程度的下降，從而造成總短鏈脂肪酸濃度的降低。

2.2.2.3 濕熱處理對各自淀粉產(chǎn)酸能力的影響 濕熱處理后，普通玉米淀粉生產(chǎn)總短鏈脂肪酸的能力有所下降，特別是在生產(chǎn)丁酸的能力方面下降得最為明顯。該結果表明濕熱處理后的玉米淀粉被微生物利用之后，有利于生產(chǎn)較多的乙酸及一定量的丙酸，但乙酸在發(fā)酵液中的過度積累會影響到丁酸的合成，因為在微生物發(fā)酵過程中，存在轉化關系：4乳酸+2醋酸=3丁酸[1，3]。丁酸的合成受到抑制的機理可能是丁酸合成酶活力不足或者在發(fā)酵過程中將乳酸和乙酸有效轉化成丁酸的微生物的增殖受到抑制。然而，濕熱處理后高直鏈玉米淀粉生產(chǎn)短鏈脂肪酸的能力得到大幅度提高，從表2中的數(shù)據(jù)分析可獲得如下結論：

a.對高直鏈淀粉進行熱處理特別是濕熱處理可以大大提高其合成短鏈脂肪酸的能力（這與普通玉米淀粉的發(fā)酵情況恰好相反），這可能是由于經(jīng)過濕熱處理之后，其內部組織結構變得更為有序，特別是濕熱處理后高直鏈玉米淀粉的發(fā)酵可以有效地提高丙酸和丁酸的濃度，而對乙酸濃度的提高影響不大，形成這樣的原因可能是由于發(fā)酵過程中微生物能有效地將乙酸轉化為丁酸，從而避免了丁酸在發(fā)酵過程中的過度積累。

b.熱處理后可以提高高直鏈淀粉發(fā)酵液中丁酸在總短鏈脂肪酸中所占的比例，無論熱處理方式如何（即干熱處理或濕熱處理），該比例均高達20%～23.8%；而對于普通玉米淀粉而言，淀粉熱處理后其發(fā)酵液中丁酸所占總短鏈脂肪酸的比例僅為2.5%～8.9%。

從表2實驗結果可以看出，腸道微生物對淀粉底物的結構特征非常敏感，這種調控機理可能是受淀粉顆粒的表面形態(tài)以及顆粒內部精細結構所影響。

對于內部結構疏松的玉米淀粉，其可被微生物快速降解成葡萄糖從而被快速地轉化成有機酸，這種微生物的發(fā)酵模式利于發(fā)酵產(chǎn)生乙酸，同時乙酸在發(fā)酵液中的過度積累可遏制丁酸的合成。對高直鏈玉米淀粉而言，熱處理后淀粉分子仍以高度有序結構排列，微生物對其降解的速度比較緩慢，葡萄糖的釋放與微生物對其利用的速率之間有一個良好的動態(tài)平衡，這樣的發(fā)酵模型不會造成乙酸在發(fā)酵液中的積累，發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙酸可有效地在短時間內被微生物酶系轉成丁酸，最后增加了發(fā)酵液中丁酸的濃度。

總體而言，增加濕熱處理次數(shù)會降低普通玉米淀粉合成丁酸的能力，而對高直鏈玉米淀粉則恰相反，一次和兩次的濕熱處理似乎能夠顯著地增加其合成丁酸的能力，但是三次濕熱處理后在其發(fā)酵液中丁酸濃度比熱處理一次和兩次的樣品有小幅的降低，但其合成丁酸的生產(chǎn)能力仍高于未處理的高直鏈玉米淀粉。

熱處理可以改善高直鏈玉米淀粉產(chǎn)丁酸的能力，這個研究結果具有一定的現(xiàn)實意義，因為在大多數(shù)食品當中的，淀粉都是經(jīng)過加熱處理后才被人體攝入。在濕熱處理可以進一步提高丁酸產(chǎn)量這一點得到證實之后，采用何種加工方式及相關工藝參數(shù)進一步提高發(fā)酵液中丁酸的濃度仍需進一步的探討。

2.2.3 不同淀粉結構對發(fā)酵合成乳酸的影響 發(fā)酵液的另外一種發(fā)酵特征是乳酸的合成，雖然其不屬于短鏈脂肪酸，但測定其含量對探討淀粉發(fā)酵機理很有幫助?？傮w而言，高直鏈玉米淀粉發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸的量遠遠低于普通玉米淀粉。兩者之間的最大區(qū)別又體現(xiàn)在高直鏈玉米淀粉的發(fā)酵過程中，熱處理（無論濕法還是干法）可大大降低乳酸的合成，這在以試圖最大化地提高丁酸產(chǎn)量為目的的發(fā)酵情況下是有利的，從另一角度也可證明在該發(fā)酵體系中乳酸和醋酸轉化合成丁酸的路線是通暢的；而對于普通玉米淀粉情況則恰恰相反，濕熱處理可以提高乳酸在發(fā)酵液中的含量，高濃度的乙酸和乳酸在發(fā)酵液中的積累說明以普通玉米淀粉為底物的發(fā)酵過程中，丁酸的合成受到一定抑制，這種抑制機理可能與底物的快速發(fā)酵機制有關。

3 結論

通過制備不同結構的淀粉進行腸道微生物的發(fā)酵，揭示了淀粉底物的結構是如何調控腸道微生物的代謝產(chǎn)物。作為人體生理功能比較強大的丁酸，其在人體腸道中的合成受到淀粉底物結構的影響。普通玉米淀粉加熱處理顯著降低其產(chǎn)生丁酸的能力，這是因為熱處理降低了其分子原有的有序性結構，這樣的底物發(fā)酵遵循快速發(fā)酵模型，這種模型會產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，且丁酸的合成會受到抑制。而對于高直鏈玉米淀粉情況則相反，熱處理對淀粉結構影響不明顯，使其仍保留較高的分子結構的有序性，其發(fā)酵遵循緩速發(fā)酵模型，這樣的模型有利于生產(chǎn)高濃度的丁酸，是從維持人體生理健康的角度所希望的一種發(fā)酵模型。

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Study on the mechanism of butyric acid production regulated by starch structure during gut bacterial fermentation

ZHOU Zhong-kai，CHEN Xiao-shan，ZHANG Yan，ZHENG Pai-yun，YANG Yan
（Tianjin University of Science and Technology，School of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin 300457，China）

A number of starches with different structures were obtained by different processing methods from normal and high amylose maize starches，and their capacities for butyrate production were measured during the gut bacterial fermentation.The relation between starch structure and butyrate production was further studied.Results showed that high amylose starch and its thermally treated samples had slowly fermenting character，and could produce butyrate as high as 19.77～27.72mmol/L.However，normal maize starch and its thermally treated samples had quickly fermenting character，and produced higher concentrations of lactate and acetate but the butyrate only with 2.48～14.19mmol/L，and thermal treatment greatly reduced butyrate production for maize starch samples.The study suggested that starch structure and butyrate-producing capacity was highly related.

starch structure；microbial fermentation；short-chain fatly acids；butyric acid

TS235.1

A

1002-0306（2014）04-0199-05

2013－01－15

周中凱（1964-），男，博士，教授，研究方向：谷物科學與營養(yǎng)。