龍海濤，薛利新，張志霞，吳龍婷，王 娟，蒲陸梅，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；4.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州730000）

固定化混合酶提取番茄紅素的工藝研究

龍海濤1，2，3，薛利新4，張志霞1，2，吳龍婷3，王 娟1，蒲陸梅1，2，*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；4.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州730000）

使用海藻酸鈉固定纖維素酶及果膠酶，對(duì)其提取番茄醬中番茄紅素的工藝進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用了響應(yīng)面優(yōu)化方法，得到的最佳條件為：酶解時(shí)間為2.8h，pH為4.0，酶解溫度50℃，酶用量為1.00g/100g，在此條件下番茄紅素提取量達(dá)到3.68μg/mL。固定化混合酶重復(fù)循環(huán)利用7次以上仍然保持了良好的穩(wěn)定性。

番茄紅素，固定化酶，果膠酶，纖維素酶，提取

番茄紅素（lycopene）是一種植物中所含的脂溶性色素，其結(jié)構(gòu)是由2個(gè)非共軛的和11個(gè)共軛的碳-碳雙鍵組成的直鏈多不飽和烯烴，經(jīng)過(guò)環(huán)化可形成β-胡蘿卜素，分子式為C40H56，熔點(diǎn)為174℃。天然存在的番茄紅素都是全反式結(jié)構(gòu)[1]。自由基能夠?qū)?xì)胞膜的功能以及結(jié)構(gòu)造成損害，番茄紅素中共軛的多個(gè)碳-碳雙鍵能夠捕獲自由基，從而使得番茄紅素具有了優(yōu)良的抗氧化性能。因此能夠有效地減少人類癌癥、心臟病、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障和老年斑的發(fā)病率[2-4]。此外，番茄紅素有著巨大的需求量，不僅可用于制藥工業(yè)，還能用于食品工業(yè)、化妝品等。

番茄一直被認(rèn)為是番茄紅素的主要來(lái)源之一，由于番茄紅素在番茄中含量比較低，因此提取效率的提高已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一，常用的方法有浸提法[5]、酶反應(yīng)法[6]、超臨界CO2流體萃取法[7]以及利用工程菌株發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素[8]，其中酶反應(yīng)法由于催化效率高，條件比較溫和，受到了廣泛的歡迎，但由于酶的價(jià)格比較高和不易回收的缺陷，限制了酶輔助法提取番茄紅素工藝的實(shí)際推廣應(yīng)用；與之相比，固定化酶不僅易于回收，而且可以重復(fù)利用，能夠降低生產(chǎn)成本，因此，本文將常用的破壁用的果膠酶及纖維素酶按照一定的比較混合后，然后用海藻酸鈉固定化，用于番茄紅素的提取工藝，實(shí)現(xiàn)了酶的回收利用。且通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，研究了用固定化的酶從番茄醬中提取番茄紅素的工藝條件，為提高番茄紅素的提取率提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄醬 新疆迪盛番茄制品有限公司；果膠酶（酶活力≥10萬(wàn)U/g）、纖維素酶（酶活力≥2000U/g）

上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸，檸檬酸三鈉，氯化鈣 分析純，天津化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉 食品級(jí)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙酸乙酯，戊二醛 分析純，上海中泰化學(xué)試劑有限公司。

電熱恒溫水浴鍋 上海市南陽(yáng)儀器有限公司；UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 番茄紅素標(biāo)含量的測(cè)定采用以蘇丹Ⅰ色素為標(biāo)準(zhǔn)物法[9]。稱取蘇丹Ⅰ色素0.025g（精確到0.0001g），用無(wú)水乙醇定容至50.00mL。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.26、0.52、0.78、1.04、1.30mL。分別注入5個(gè)50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至50.00mL，此溶液即相當(dāng)于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后依次在472nm波長(zhǎng)下，分別測(cè)定吸光度。以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，蘇丹Ⅰ色素標(biāo)準(zhǔn)溶液所相當(dāng)?shù)姆鸭t素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，用Microcal Origin 6.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=0.2307x-0.0155，r= 0.9997。

1.2.2 固定化酶的制備 將一定濃度的酶液加入到4g/100mL的海藻酸鈉水溶液中，于37℃下攪拌均勻；用蠕動(dòng)泵將混合液從5cm高度處滴入3%的CaCl2水溶液中形成凝膠珠，在4℃條件下硬化一段時(shí)間。得到顆粒直徑約為3mm、形狀為球形的海藻酸鈉固定化酶；將所得微球用0.5%的戊二醛液浸泡16h后，分別用蒸餾水、去離子水洗滌，4℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.3 酶用量的確定 稱取番茄醬100g，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，依次各加入含有游離酶0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g的固定化的果膠酶，pH為7，45℃酶解1h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定固定化果膠酶的最佳用量。再按同樣上述方法確定固定化纖維素酶的最佳用量。

1.2.4 酶混合比例的確定 稱取番茄醬100g，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入固定化果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，總酶量為1.2g/100g，pH為7，于45℃酶解1h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定混合酶的最佳比例。

1.2.5 混合酶用量的確定 稱取番茄醬100g，分別裝在6個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，在纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為1∶2的條件下，分別加入總酶量0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6g，pH為7，于45℃酶解1h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定混合酶最佳用量。

1.2.6 酶解pH的確定 稱取番茄醬100g，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，用檸檬酸-檸檬酸三鈉溶液依次調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，而后往三角瓶中分別加入1.0g的混合酶，其中纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶2，于45℃酶解1h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100 mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定最佳pH。

1.2.7 酶解溫度的確定 稱取番茄醬100g，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入1.0g的混合酶，其中纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶2，pH為4，分別在30、35、40、45、50、55℃下，酶解1h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定酶解的最佳溫度。

1.2.8 酶解時(shí)間的確定 稱取100g的番茄醬，分別裝在5個(gè)250mL的帶塞三角瓶中，加入1.0g的混合酶，其中纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶2，pH為4，于50℃酶解1、2、3、4、5h，冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯100mL浸提1h，取上層有機(jī)相過(guò)濾后，測(cè)定濾液中番茄紅素濃度。確定酶解的最佳時(shí)間。

1.2.9 酶解最佳提取條件的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶2，通過(guò)混合酶用量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間4個(gè)主要因素，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以確定酶解提取番茄紅素的最佳條件。

表1 果膠酶和纖維素酶提取番茄紅素的因素水平編碼表Table.1 Factors and levels for the Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 酶單獨(dú)用量對(duì)番茄紅素提取的影響

圖1 果膠酶、纖維素酶單獨(dú)使用對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.1 Effect of individual hydrolysis of tomato by cellulase and pectinase on lyopene extraction

由圖1可見(jiàn)，單獨(dú)使用果膠酶酶解提取番茄紅素時(shí)，隨著酶用量的增多，番茄紅素質(zhì)量濃度逐漸增加，但是超過(guò)最佳用量后質(zhì)量濃度反而下降。果膠酶最佳用量是1.0g/100g，此時(shí)番茄紅素的質(zhì)量濃度可達(dá)2.14μg/mL；纖維素酶隨著酶用量的增加，質(zhì)量濃度先升高，而后逐漸下降，最佳用量是1.2g/100g，此時(shí)番茄紅素的質(zhì)量濃度可達(dá)2.30μg/mL。而且圖1中可以看出，纖維素酶的提取效率與果膠酶提取基本相當(dāng)，這個(gè)與袁春龍等[11]所報(bào)道的果膠酶效果優(yōu)于纖維素酶的結(jié)論有所差異，可能是所用番茄的品種存在差異。果膠酶和纖維素酶是主要的破壁酶，能夠釋放出封閉在細(xì)胞里面的番茄紅素，從而使得提取率大幅提高。

2.2 酶混合比例對(duì)番茄紅素提取的影響

圖2 纖維素酶和果膠酶混合比例的確定Fig.2 Effect of pectinase/cellulase ratio on lyopene extraction

由圖2可知，隨著纖維素酶和果膠酶的比例的逐漸升高，番茄紅素質(zhì)量濃度也逐漸升高，二者的比例在1∶2時(shí)，番茄紅素質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，此后隨著比例的增加，番茄紅素質(zhì)量濃度隨之減少，因此選擇最佳質(zhì)量比例為1∶2，此時(shí)番茄紅素的質(zhì)量濃度可達(dá)2.40μg/mL。

圖1和圖2可知，單獨(dú)使用酶時(shí)，番茄紅素的最大質(zhì)量濃度可達(dá)2.30μg/mL，混合酶使用時(shí)，番茄紅素的質(zhì)量濃度可達(dá)2.40μg/mL，因此選用混合酶作為破壁酶。

2.3 混合酶用量對(duì)番茄紅素提取的影響

圖3 混合酶用量對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.3 Effect of total dosage of pectinase and cellulase on lycopene extraction

由圖3可見(jiàn)，纖維素酶和果膠酶以1∶2的比例混合均勻，隨著混合酶總量的增多，番茄紅素質(zhì)量濃度緩慢升高，至1.0g/100g達(dá)到最大，故選擇最佳用量為1.0g/100g。過(guò)多的固定化酶不僅不能提高提取率，反而造成了提取率的下降，這個(gè)主要是由于果膠在酶的作用下水解產(chǎn)物β-半乳糖醛酸等聚集在固定化酶的附近，從而改變了固定化酶的微環(huán)境，產(chǎn)生了擴(kuò)散限制效應(yīng)，使得番茄紅素質(zhì)量濃度反而下降。

2.4 pH對(duì)番茄紅素提取的影響

由圖4可知，在纖維素酶和果膠酶最佳比例1∶2，用量1.0g/100g，45℃酶解1h，隨著提取液pH的升高，提取率先上升后下降，當(dāng)pH4.0時(shí)，番茄紅素質(zhì)量濃度最大，故選擇最佳pH為4.0。袁永成[12]研究表明，番茄紅素在堿性條件下比較穩(wěn)定，因此條件選擇傾向于pH比較大的條件，但是果膠酶的最佳酶活在pH3.8，纖維素酶的最佳酶活在pH5.0，最佳酶活存在的pH與番茄紅素最穩(wěn)定的pH兩者之間存在沖突，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究選擇最佳pH為4.0。

圖4 pH對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.4 Effect of pH on lycopene extraction

2.5 酶解溫度的確定

圖5 酶解溫度對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on lycopene extraction

由圖5可見(jiàn)，纖維素酶和果膠酶的比例1∶2，用量1.0g/100g，pH4.0，酶解1h，隨著酶解溫度的升高，番茄紅素質(zhì)量濃度先升高再下降，在50℃時(shí)達(dá)到最大，故選擇酶解溫度為50℃。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)番茄紅素提取的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)番茄紅素提取的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on lycopene extraction

由圖6可知，纖維素酶和果膠酶的比例1∶2，用量1.0g/100g，在50℃、pH4.0條件下提取番茄紅素，隨著酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄紅素質(zhì)量濃度迅速增加，當(dāng)達(dá)到2h時(shí)，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，其質(zhì)量濃度趨于下降，所以酶解時(shí)間確定為2h。時(shí)間越長(zhǎng)，一方面番茄紅素在空氣中容易被氧化，導(dǎo)致番茄紅素質(zhì)量濃度的下降，另一方面，時(shí)間長(zhǎng)在工藝上來(lái)說(shuō)會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)的周期，也會(huì)造成不利影響。此結(jié)果與Sheetal M等[13]報(bào)道的時(shí)間為20min有所不同，主要是由于他們所采用的酶為游離酶，且提取溫度為25℃，所以需要的時(shí)間較短。

2.7 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.7.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken的4因素3水平實(shí)驗(yàn)的取值見(jiàn)表2，共27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。其中實(shí)驗(yàn)號(hào)1～4和8～27是析因?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)號(hào)5～7是中心實(shí)驗(yàn)。這27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[14]。

2.7.2 回歸方程建立與方差分析 通過(guò)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，由表3可知二次回歸方程為：

Y3=62.77+1.64X1-2.27X2+4.66X3-0.46X4-0.57X1X2-3.5X1X3+4.84X1X4-1.04X2X3+0.56X2X4-3.88X3X4-22.17X12-21.93X22-9.28X32-24.91X42。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2 Design and test results of response surface analysis

表3 Box-Behnken回歸方程的方差分析Table.3 Variance analysis of regression equation forBox-Behnken experiments

2.7.3 響應(yīng)曲面的分析以及最佳操作點(diǎn)的確定 根據(jù)回歸分析結(jié)果（表2）做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 酶解時(shí)間和酶用量對(duì)提取量的影響Fig.7 Response surface plot of combined effects of time and total dosage of pectinase and cellulase on extracting rate

圖7為酶解時(shí)間和酶用量之間的交互作用。提高酶解時(shí)間和混合酶用量均能提高番茄紅素的質(zhì)量濃度。當(dāng)時(shí)間處于中心點(diǎn)時(shí)，番茄紅素的質(zhì)量濃度表現(xiàn)出隨著酶用量先升高后下降的趨勢(shì)。為了確定各因素的最優(yōu)值，利用SAS軟件的Rsreg程序進(jìn)行典型分析，通過(guò)分析后得到最優(yōu)條件：酶解時(shí)間為2.84h，pH為3.94，酶解溫度50.4℃，酶用量為1.01g/100g，此時(shí)番茄紅素的質(zhì)量濃度為3.65μg/mL。

2.7.4 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了實(shí)驗(yàn)的方便性，將上述優(yōu)化條件進(jìn)行校正，選擇酶解時(shí)間為2.8h，pH為4.0，酶解溫度為50℃，混合酶用量為1.0g/100g，纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1∶2，共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果番茄紅素的質(zhì)量濃度為3.68μg/mL，與預(yù)測(cè)值3.65μg/mL接近，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際酶解情況。

2.8 固定化酶處理番茄紅素的重復(fù)利用率

將酶解后的殘?jiān)^(guò)濾，然后將殘?jiān)?00目的篩子浮選，將上層的固定化酶分離出來(lái)，而后用蒸餾水清洗，微球用0.5%的戊二醛液浸泡16h，分別用蒸餾水、去離子水洗滌，4℃保存?zhèn)溆?。?.2.3的方法和2.7.4確定的最佳條件下將固定化酶重復(fù)使用7次，得到的番茄紅素提取液質(zhì)量濃度結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8可知，固定化酶重復(fù)回收使用7次，其提取液的番茄紅素質(zhì)量濃度依然大于不使用固定化酶的提取液的番茄紅素質(zhì)量濃度。此外，從圖8也可以看見(jiàn)，使用混合的游離酶其效果要好于固定化酶，但是游離酶不能重復(fù)使用，而固定化酶可以多次使用，所以經(jīng)濟(jì)效應(yīng)優(yōu)于游離酶，因此，固定化酶有著其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。

圖8 酶處理次數(shù)對(duì)提取效果的影響Fig.8 Effect of enzyamtic treatment batch on the extraction of lycopene from tomato

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用價(jià)格相對(duì)低廉和低毒的乙酸乙酯為提取溶劑，經(jīng)響應(yīng)曲面法優(yōu)化后確定的番茄紅素提取實(shí)驗(yàn)的最佳條件為：酶解時(shí)間為2.8h，pH為4.0，酶解溫度50℃，酶用量為1.00g/100g，在此條件下番茄紅素提取量達(dá)到3.68μg/mL。

采用固定化酶可以實(shí)現(xiàn)酶活力的緩慢釋放，酶的穩(wěn)定性要比游離狀態(tài)的好，而且還可以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，節(jié)約生產(chǎn)成本；其次番茄紅素提取采用固定化酶雖然已有報(bào)道[15]，但是以往的報(bào)道中大多采用固定一種酶，而對(duì)于混合酶的固定化應(yīng)用于番茄紅素的提取未見(jiàn)報(bào)道，而且本文中用了番茄紅素的質(zhì)量濃度來(lái)衡量提取率，相對(duì)于以往用吸光度衡量更加直觀反映出提取效果。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，番茄紅素的需求量越來(lái)越大，但番茄紅素提取率一直較低，本文通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到了比現(xiàn)有方法更高的提取率的理論模型及數(shù)據(jù)，而且隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，將來(lái)在固定化載體技術(shù)方面突破，那么固定化酶的活性將會(huì)得到進(jìn)一步提高，會(huì)產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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Extraction of lycopene from tomato paste with immobilized pectinase and cellulase

LONG Hai-tao1，2，3，XUE Li-xin4，ZHANG Zhi-xia1，2，WU Long-ting3，WANG Juan1，PU Lu-mei1，2，*
（1.College of Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；3.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；4.Gansu Center for Disease Prevention and Control，Lanzhou 730000，China）

Pecinase and cellulase were immobilized on sodium alginate and was applied in the extraction of lycopene from tomato paste.Based on single factor experiments，response surface optimization method was used to determine the optimal conditions for immobilization.Results showed that the using immobilized pectinase and cellulase could improve the extraction rate of lycopene from tomato paste and the best time，pH，extraction temperature，enzyme-tomato mass ratio value were 2.8h，4.0，50℃and 1.00g/100g respectively.Under these conditions，the extraction rate of lycopene was 3.68μg/mL.The immobilized pectinase and cellulase showed high stability，and could be used for 7 batches and its properties still kept fine performance.

lycopene；immobilized enzymes；pectinase；cellulase；extraction

TS202.1

A

1002-0306（2014）04-0189-05

2013－06－07 *通訊聯(lián)系人

龍海濤（1982-），男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

甘肅省財(cái)政廳資助。