夏 姣，蒲 彪，敖曉琳，陳安均，崔慧玲，袁 楊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625114）

傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過程中明串珠菌的分離鑒定

夏 姣，蒲 彪*，敖曉琳，陳安均，崔慧玲，袁 楊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625114）

分別以紅皮蘿卜、卷心菜、豇豆為原料，用自然發(fā)酵法制作了三種四川泡菜。對(duì)三種泡菜發(fā)酵過程中的明串珠菌進(jìn)行分離，主要得到四種不同形態(tài)的菌株，將其分別命名為：MC-1、MC-2、MC-13、J-5，其中J-5為豇豆泡菜特有，其余為三種泡菜共有。采用生理生化結(jié)合16SrDNA序列鑒定對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定，依次鑒定為：乳明串珠菌（L.lactis）、腸膜明串株菌葡聚糖亞種（L.mesenteroides subsp.dextranicum）、檸檬明串珠菌（L.citreum）、假腸膜明串珠菌（L.pseudomesenteroide）。對(duì)發(fā)酵過程中明串珠菌動(dòng)態(tài)分析表明：L.lactis、L.mesenteroides subsp.dextranicum為三種泡菜中的主要優(yōu)勢(shì)明串珠菌；L.citreum在發(fā)酵第2～4d出現(xiàn)后很快又消失；L.pseudomesenteroide在豇豆發(fā)酵的第3～9d比較活躍；泡菜發(fā)酵到第11d，泡菜水中所有的L.lactis都消失。

四川泡菜，明串珠菌，16SrDNA，動(dòng)態(tài)變化

四川泡菜是以蔬菜為原料，添加或不添加輔料，在多種微生物作用下經(jīng)鹽水泡制而成的發(fā)酵蔬菜，其味道咸酸爽口，自然清純，既可以作為佐餐食用，也可以作為調(diào)味菜食用。泡菜具有凈腸、抗菌、抗癌、抗衰老、抗動(dòng)脈硬化和抗肥胖、抗突變活性和預(yù)防腦溢血等作用[1]，是世界公認(rèn)的三大健康發(fā)酵蔬菜腌制品之一。明串珠菌（Leuconostoc）是一類進(jìn)行異型發(fā)酵的革蘭氏陽性、耐氧的乳酸細(xì)菌，其屬內(nèi)包括腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）、乳明串珠菌（L.lactis）、檸檬明串珠菌（L.citreum）、假腸膜明串珠菌（L. pseudomesenteroide）等13個(gè)種[2]。在泡菜發(fā)酵初期，明串珠菌比較活躍。Pederson曾指出啟動(dòng)泡卷心菜發(fā)酵的菌種為腸膜明串珠菌[3]。目前，關(guān)于泡菜中的乳桿菌有大量的研究，而對(duì)明串珠菌研究很少，只有部分學(xué)者分離到腸膜明串珠菌。本實(shí)驗(yàn)以三種蔬菜（紅皮蘿卜、豇豆、卷心菜）為原料制作泡菜，對(duì)其發(fā)酵過程中存在的明串珠菌進(jìn)行分離鑒定，旨在分析泡菜發(fā)酵過程的明串珠菌菌群及其動(dòng)態(tài)變化，為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)過程中發(fā)酵菌種的選擇提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土墻溫室跨度大，荷載重，因此，對(duì)骨架要求比較嚴(yán)格。對(duì)于無立柱日光溫室，骨架荷載能力比較弱的，加立柱，根據(jù)骨架結(jié)構(gòu)和材料，東西方向每4-6m加一鋼立柱或水泥立柱。對(duì)于鋼架和竹片(PVC管)混搭的骨架，全部更新為1m間隔的鋼骨架。具有的骨架改造也可以根據(jù)日光溫室的實(shí)際情況選擇改造方法。

紅皮蘿卜、豇豆、卷心菜 雅安市售；2×PCR Master Mix、離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒北京天根生物科技有限公司；蔗糖硫胺培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、葡聚糖生成培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 按文獻(xiàn)[4]配制。

Powerpac Basic電泳儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)、MycyclerTMThermal Cycler PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；CX21S1電子顯微鏡 日本OLYMPUS公司；YXQ.SG41.280高壓蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

表1 菌落形態(tài)特征及個(gè)體特征Table.1 Colony morphology and microscopy morphology

1.2.5 明串珠菌種類動(dòng)態(tài)分析 分別取發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7、9、11、13d卷心菜泡菜水、紅皮蘿卜泡菜水、豇豆泡菜水來進(jìn)行明串珠菌的動(dòng)態(tài)分析。取合適稀釋度的泡菜水涂布于蔗糖硫胺平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)，并對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行記錄。

用外圓內(nèi)方來概括全新路虎發(fā)現(xiàn)非常恰當(dāng)，而圓與方拋開形似外更有哲學(xué)層面的意義。圓更符合這個(gè)時(shí)代人們對(duì)于傳統(tǒng)汽車外形的共同認(rèn)知，方則體現(xiàn)著路虎并不愿徹底向時(shí)代讓步從而忘卻經(jīng)典本真。從哲學(xué)層面的意義來理解，全新路虎發(fā)現(xiàn)并沒有失去人們?cè)?jīng)喜歡的那種類似工具車的硬派與酷，如今的它只是將曾經(jīng)外露的性格藏在了車內(nèi)。

1.2.1 泡菜制作 將蔬菜原料（紅皮蘿卜、豇豆、卷心菜）清洗、切分、晾干后分別放入泡菜壇中，以料液比1∶2（g/mL）加入鹽濃度為6%的滅菌鹽水于室溫條件下發(fā)酵。

1.2.2 泡菜汁中明串珠菌的分離篩選 取不同發(fā)酵時(shí)期的泡菜液作梯度稀釋后，涂布于蔗糖硫胺固體培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，挑取不同形態(tài)的單菌落在溴甲酚紫-蔗糖硫胺培養(yǎng)基（添加5～10mL 0.1%溴甲酚紫）上劃線，純化2次，將能產(chǎn)酸且菌落形態(tài)明顯的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和H2O2酶測(cè)定。選革蘭氏陽性、H2O2酶陰性且鏡檢形態(tài)為球形或橢球形的菌株保種。

1.2.3 菌株的鑒定

圖1為壓電振動(dòng)能量俘獲系統(tǒng)的典型架構(gòu)。壓電振動(dòng)能量轉(zhuǎn)換裝置將環(huán)境振動(dòng)能轉(zhuǎn)換為交流電能,整流器將交流電轉(zhuǎn)換為直流電。第3級(jí)中的電壓變換模塊用于調(diào)節(jié)直流電壓,提高電壓品質(zhì),以滿足負(fù)載需求。壓電振動(dòng)能量俘獲系統(tǒng)的效率主要取決于整流器及電壓變換的效率。因此,提高整流器的工作效率對(duì)于壓電振動(dòng)能量俘獲系統(tǒng)而言至關(guān)重要。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，目的片段長(zhǎng)度在1.5kbp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測(cè)序。

1.2.3.2 分子方法鑒定 用試劑盒提取菌株的總DNA，以27f、1492r為引物對(duì)擴(kuò)增菌株16SrDNA序列。其引物序列：正向引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′；反向引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′[6]。

簡(jiǎn)言之，家庭、戰(zhàn)爭(zhēng)和性別身份給蕭紅和伍爾夫帶來了種種的創(chuàng)傷經(jīng)歷和創(chuàng)傷記憶，而文學(xué)書寫成為兩位作家表達(dá)創(chuàng)傷痛苦、打破創(chuàng)傷沉默的方式。無論是蕭紅碎片化的敘事呈現(xiàn)還是伍爾夫的意識(shí)流創(chuàng)作手法，不斷打破敘事時(shí)間的連貫性、敘事人物的一致性和敘事結(jié)構(gòu)線性發(fā)展的都是反復(fù)出現(xiàn)的創(chuàng)傷記憶。猶如創(chuàng)傷的記憶不斷侵入作者的意識(shí)一般，這些創(chuàng)傷的記憶一再侵入情節(jié)的發(fā)展之中，也因此打破了敘事的連貫性，使得作品敘事呈現(xiàn)出碎片化的表征。

1.2.3.1 生理生化鑒定 生化鑒定方法參照文獻(xiàn)[4-5]，根據(jù)菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征及生理生化特性初步確定其分類地位。

經(jīng)歷了這些劫難，沈老七可以說是一貧如洗。劉二自然也出了沈家的門。他并沒有再回老家，而是在張滿春的撮合下，到河口一陳姓人家做了上門女婿。那丫頭長(zhǎng)得碩實(shí)，且有一雙沒有被纏裹過的大腳，比劉二小九歲。

由于微課程需要在手機(jī)中運(yùn)行，因此設(shè)計(jì)微信微課程時(shí)應(yīng)該充分考慮智能手機(jī)的性能，學(xué)習(xí)者善于接受的學(xué)習(xí)方式等特點(diǎn)，基本的設(shè)計(jì)原則有以下幾點(diǎn)：

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)并與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相關(guān)序列進(jìn)行比較，將相似度高的序列與測(cè)定序列通過Clustalx進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用MEGA軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

對(duì)不同蔬菜（紅皮蘿卜、卷心菜、豇豆）泡制過程中明串珠菌種類的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行記錄，所得結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，J-5（L.pseudomesenteroide）是泡豇豆中特有的明串珠菌，而MC-1、MC-2、MC-13為三種泡菜共有，且泡菜泡制7d后泡菜水中明串珠菌逐漸消失。

在蔗糖硫胺培養(yǎng)基表面挑選出四株有明顯菌落形態(tài)、革蘭氏陽性、H2O2酶陰性、產(chǎn)酸明顯的菌株，分別編號(hào)為：MC-1、MC-2、MC-13、J-5。其溴甲酚紫-蔗糖硫胺培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征及個(gè)體形態(tài)特征見表1，照片見圖1。2.2 生理生化特性

圖1 菌落形態(tài)特征及個(gè)體特征Fig.1 Colony morphology and microscopy morphology

各菌株1℃、37℃、pH=4.8的生長(zhǎng)情況、耐鹽性和乙醇耐受力、葡聚糖產(chǎn)生、運(yùn)動(dòng)性、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、多種碳水化合物發(fā)酵情況，結(jié)果見表2。結(jié)果來看，MC-2可利用蔗糖產(chǎn)生葡聚糖，不發(fā)酵阿拉伯糖和甘露醇，依據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]，其可能為腸膜明串株菌；MC-13和J-5能發(fā)酵阿拉伯糖、麥芽糖、果糖，不發(fā)酵乳糖，1℃不生長(zhǎng)，不能利用蔗糖產(chǎn)葡聚糖，其可能為檸檬明串珠菌或假腸膜明串珠菌；而根據(jù)MC-1以上的生理生化特性還不能將其鑒定出來。

表2 菌株生理生化特性Table.2 Physico-chemical characteristics

2.3 16SrDNA鑒定

提取的實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到了一條明顯的亮帶，說明所采用提取DNA的方法準(zhǔn)確有效。將所得DNA作為模板進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有1500bp目的條帶，且清晰可見，無雜帶，可用于菌株16SrDNA測(cè)序。供試菌基因組DNA電泳圖和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖分別見圖2、圖3。

圖2 基因組DNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of genomic DNA

圖316SrDNA電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of16Sr DNA

測(cè)序結(jié)果在NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)通過BLAST比對(duì)，以酒類酒球菌序列作為外源菌序列，連同同源性較高菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖4。

圖416SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences注：L.：Leuconostoc。

由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，實(shí)驗(yàn)分離的菌株均屬于明串珠菌屬，其中MC-1與L.lactis（HF562949）和L.lactis（EU419609）聚在一起，且它們的相似度達(dá)到99%以上，因而MC-1被鑒定為乳明串珠菌。MC-13與L.citreum（HF562953）同源性達(dá)到100%，被鑒定為檸檬明串株菌。J-5與L.pseudomesenteroide（AB795647）聚在一起，為假腸膜明串珠菌。而MC-2與L. mesenteroides subsp.mesenteroides（AB680071）和L. mesenteroides subsp.dextranicum（HF562942）聚在一起，其可能為腸膜明串珠菌腸膜亞種或腸膜明串珠菌葡聚糖亞種，結(jié)合MC-2之前的生理生化特性，將其鑒定為腸膜明串珠菌葡聚糖亞種。

潑尼松是一種糖皮質(zhì)激素類藥物，可以顯著增強(qiáng)抗炎功效，對(duì)毛細(xì)血管擴(kuò)張和增生發(fā)揮抑制作用，有效減輕炎性因子對(duì)神經(jīng)節(jié)的破壞，血管通透性降低，并且可以有效避免瘢痕。

分離菌株MC-1、MC-2、MC-13、J-5的16SrDNA序列已注冊(cè)到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)依次為KF150180、KF150179、KF150181、KF150182。

表3 明串珠菌的動(dòng)態(tài)變化Table.3 Dynamic change of Leuconostoc

2.4 不同泡菜中明串珠菌的動(dòng)態(tài)變化

PCR擴(kuò)增體系：2×PCR Master Mix 12.5μL、引物各1μL、模板DNA1μL、ddH2O補(bǔ)至25μL。

4) 將 windML_INTEL_GMCH_DB.cfg 文件放置在C:Tornado221host esourcewindMLconfigdatabase 路徑下(本文假設(shè)VxWorks 開發(fā)環(huán)境安裝在 C:Tornado221 路徑下);

泡菜泡制第1d，MC-1、MC-2開始活躍，分別在第9、7d開始出現(xiàn)消減趨勢(shì)，直到發(fā)酵第11d，才全部消失，其可能為泡制前期的優(yōu)勢(shì)菌種；MC-13只出現(xiàn)在發(fā)酵第2～4d，且出現(xiàn)后隨即消失；J-5在豇豆泡制3～9d均有檢出，而在其他泡菜中未檢測(cè)到。此外，三種不同蔬菜發(fā)酵過程中出現(xiàn)的明串珠菌種類及其動(dòng)態(tài)變化大致相同，由于自然發(fā)酵泡菜中微生物主要來自蔬菜原料，這說明存在于不同蔬菜原料的明串珠菌種類大致相同。

3 討論

3.1 泡菜中明串珠菌的種類分析

實(shí)驗(yàn)從不同的蔬菜（紅皮蘿卜、卷心菜、豇豆）發(fā)酵過程中分離到了四株明串珠菌，分別為乳明串珠菌（L.lactis）、腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）、檸檬明串株菌（L.citreum）、假腸膜明串珠菌（L. pseudomesenteroide）。

乳明串珠菌主要分離自乳和乳制品，薛永春等[8]、張敏等[9]、李少英等[10]從不同地區(qū)的乳及乳制品中分離到了乳明串珠菌，葛菁萍等[11]在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中檢測(cè)出了乳明串珠菌。而賀衛(wèi)華等[12]、王福金等[13]則分別從碳酸飲料和日糧中分到了假腸膜明串珠菌。關(guān)于從泡菜中分離到L.lactis、L. pseudomesenteroide未見報(bào)道。這可能與研究泡菜取樣的時(shí)間間隔及所采用培養(yǎng)基不同有關(guān)，大部分學(xué)者對(duì)于泡菜乳酸菌的研究一般只取發(fā)酵過程中的某幾個(gè)點(diǎn)或直接取發(fā)酵成熟的樣品進(jìn)行研究，而采用的培養(yǎng)基則常為MRS培養(yǎng)基，而明串珠菌在泡菜發(fā)酵過程中主要活躍于前期或中期，且在MRS培養(yǎng)基上的形態(tài)特征不明顯。

Choi等[14]、Hyun等[15]從韓國(guó)泡菜中分到了檸檬明串珠菌，而國(guó)內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。可能是由于檸檬明串珠菌不是國(guó)內(nèi)泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌，其存在于泡菜中的時(shí)間較短所致。腸膜明串珠菌是泡菜發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌，國(guó)內(nèi)外已有多位學(xué)者從泡菜中分離到了該菌，如Eom等16]、燕萍梅等[17]。

3.2 明串珠菌動(dòng)態(tài)分析

實(shí)驗(yàn)分離所得的四株菌在蔗糖硫胺平板上有明顯不同的菌落形態(tài)。MC-1、MC-2能利用蔗糖產(chǎn)生粘性物質(zhì)而導(dǎo)致其菌落形態(tài)跟之前報(bào)道[18]的形態(tài)不一樣。MC-13在蔗糖硫胺培養(yǎng)基上的形態(tài)呈多皺的輻射狀，使得與J-5、MC-1、MC-2菌落很好區(qū)分。雖然蔗糖硫胺培養(yǎng)基對(duì)于明串珠菌是半選擇性培養(yǎng)基，但是實(shí)驗(yàn)分離菌在該平板上的菌落形態(tài)特征很明顯，同時(shí)在明串珠菌屬內(nèi)，能利用蔗糖產(chǎn)生粘性物質(zhì)的菌種類也有限。所以該研究關(guān)于明串珠菌動(dòng)態(tài)分析結(jié)果有一定可靠性。

該研究中腸膜明串珠菌在泡菜發(fā)酵的第7d開始消失，與Tao Xiong等[19]研究中腸膜明串珠菌在泡菜發(fā)酵第5d開始消失較接近。明串珠菌在泡菜發(fā)酵的1～7d比較活躍，后逐漸消失，與國(guó)外學(xué)者得出的泡菜發(fā)酵由明串珠菌啟動(dòng)這一結(jié)論相符合[20]。

3.每個(gè)隊(duì)員摸一次，摸球時(shí)不準(zhǔn)看，每次摸球后都要放回箱子，負(fù)責(zé)拿箱子的同學(xué)晃動(dòng)箱子，使球混合均勻，接著再摸，摸出紅球多的為勝。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從三種泡菜發(fā)酵過程中分離到四種明串珠菌MC-1、MC-2、MC-13、J-5，其依次為乳明串珠菌（L.lactis）、腸膜明串株菌葡聚糖亞種（L.mesenteroides subsp.dextranicum）、檸檬明串珠菌（L.citreum）、假腸膜明串珠菌（L.pseudomesenteroide）。除了豇豆泡菜以外，其他兩種泡菜水中均未檢測(cè)到假腸膜明串珠菌。此外，三種泡菜發(fā)酵過程中明串珠菌的動(dòng)態(tài)變化種類及其變化趨勢(shì)大體一致。

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Separation and identification of Leuconostoc during the fermentation of sichuan pickles

XIA Jiao，PU Biao*，AO Xiao-lin，CHEN An-jun，CUI Hui-ling，YUAN Yang
（College of Food，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625114，China）

The Leuconostoc throughout spontaneous fermentation of three kinds of Sichuan pickles were analyzed.Four strains of different colony morphology were separated，and named MC-1，MC-2，MC-13，J-5. J-5 only existed in the bean pickle，others existed in all kinds of pickles.After some physiological and biochemical tests and sequencing the 16SrDNA sequence of the four strains，MC-1 was identified as L.lactis，and MC-2 was L.mesenteroides subsp.dextranicum，MC-13 was L.citreum and J-5 was L.pseudomesenteroide. Dynamic results showed that L.lactis and L.mesenteroides subsp.dextranicum were the dominant Leuconostoc，they presented in the brine as soon as vegetables pickled，L.citreum presented in the 2～4th day and disappeared soon，L.pseudomesenteroide existed in 3～9th day.All the L.lactis disappeared till the 11th day.

sichuan pickle；Leuconostoc；16SrDNA；dynamic change

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0153-05

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

夏姣（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：果蔬加工理論與技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171726）。