聶瑞艷，劉月嬌，劉敏，劉尊英

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物的穩(wěn)定性研究

聶瑞艷，劉月嬌，劉敏，劉尊英*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

以羅非魚魚鱗為原料制備肽-鈣復(fù)合物，以鈣的結(jié)合量為指標(biāo)，研究了體外胃腸道模擬消化、小腸刷狀緣膜酶、共存食物成分、pH、熱處理等因素對羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物對消化酶、小腸刷狀緣膜酶的降解具有較高的耐受性，對NaCl、乳糖具有較好的穩(wěn)定性（p＞0.05）；但對50℃以上的熱處理較為敏感，鈣結(jié)合量顯著下降（p＜0.05）。魚鱗肽鈣復(fù)合物在pH2.0的酸性條件下易于解離，但在弱堿性條件比較穩(wěn)定，pH9.0時鈣結(jié)合率可達(dá)89.65%。推測肽鈣復(fù)合物在小腸內(nèi)主要以結(jié)合物的形式存在以阻止鈣在堿性條件下的沉淀。

羅非魚，魚鱗，肽鈣復(fù)合物，穩(wěn)定性

魚鱗是水產(chǎn)品加工中的主要副產(chǎn)物，占總量的5%左右。由于傳統(tǒng)觀念和技術(shù)的限制，我國魚鱗等副產(chǎn)物因利用不當(dāng)而造成浪費(fèi)的現(xiàn)象日益突出[1]，每年廢棄的魚鱗多達(dá)30萬t[2-3]。近年來隨著魚類產(chǎn)品加工量的逐年增加，由此產(chǎn)生的魚鱗副產(chǎn)物也逐年升高，亟待利用解決。目前，關(guān)于魚鱗的高值化利用研究，國內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道。楊立等[4]以草魚魚鱗為原料，采用堿性蛋白酶酶解的工藝制備了抗氧化活性的多肽。吳繼魁等[5]等通過正交實(shí)驗(yàn)探討了草魚魚鱗中卵磷脂的提取工藝，其研究結(jié)果為魚鱗蛋白和脂肪的高值化利用提供了重要的參考數(shù)據(jù)。魚鱗中蛋白（41%～55%）和鈣鹽（38%～46%）含量較高，而關(guān)于魚鱗蛋白與鈣的關(guān)系研究報(bào)道卻很少。因此，本文以羅非魚魚鱗為原料制備魚鱗肽鈣復(fù)合物，探討其在不同處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，以期為肽鈣營養(yǎng)補(bǔ)充劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶、風(fēng)味酶 南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 上海滬西分析儀器廠；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚鱗肽鈣復(fù)合物的制備 羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物的制備參照文獻(xiàn)[6-7]的方法進(jìn)行。具體流程如下：羅非魚魚鱗→清洗、脫鹽、烘干、粉碎→1∶10（w/v）加蒸餾水→調(diào)pH加酶酶解→滅酶→離心→上清液→加CaCl2→無水乙醇沉淀→離心去上清→沉淀冷凍干燥→魚鱗肽鈣復(fù)合物。

其中羅非魚魚鱗酶解采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分步酶解的方法，分別在其最適宜條件下進(jìn)行，酶解條件如表1所示。

表1 羅非魚魚鱗蛋白的酶解條件Table.1 The hydrolysis conditions of the tilapia fish scale protein

1.2.2 魚鱗及魚鱗肽鈣復(fù)合物成分測定 水分含量采用直接干燥法測定（GB 5009.3-2010）；蛋白質(zhì)含量用微量凱氏定氮法測定（GB 5009.5-2010）；磷含量采用鉬藍(lán)比色法測定（GB 5537-85）；游離鈣離子含量采用EDTA滴定法測定（GB/T 15452-2009）。

1.2.3 肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量的測定 向待測樣品加入終濃度為50%的無水乙醇，離心、分離，收集上清液，準(zhǔn)確移取上清液定容至50mL，測定時取10mL樣品，置于250mL三角燒瓶中，加入50mL蒸餾水、2mL 1∶1的三乙醇胺、2mL 20%NaOH、2mL 10%硫化鈉，搖勻靜置2～3min，加入0.1g鹽酸羥胺，搖勻溶解，調(diào)pH至12.5，加少許鈣紅指示劑，立即用EDTA滴定至純藍(lán)色。同時用蒸餾水做空白。

上清液中游離鈣含量（mg）=fc1（v1-v0）m

其中：c1為EDTA的濃度（mol/L）；v1為EDTA的滴定體積（mL）；v0為空白消耗EDTA的體積（mL）；m為鈣的相對原子質(zhì)量；f為稀釋倍數(shù)。

肽鈣復(fù)合物中鈣結(jié)合量=樣品中鈣含量-上清液中游離鈣含量。

1.2.4 肽鈣復(fù)合物體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn) 體外模擬消化參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。將魚鱗肽鈣復(fù)合物配制成1%的溶液，用1mol/L HCl調(diào)pH2.0，加入1%（E/S）的胃蛋白酶在37℃條件下分別消化1、2h時取出樣品，沸水浴滅酶5min，冷卻至室溫，胃蛋白酶消化結(jié)束后，用1mol/L NaOH將pH調(diào)至8.0，加入1%（E/S）胰蛋白酶在37℃條件下繼續(xù)消化，分別于1、2h時取出樣品，沸水浴滅酶5min，冷卻至室溫。將上述不同時期的樣品加入無水乙醇沉淀，8000r/min離心10min，吸取上清，0.45μm微孔濾膜濃縮，于容量瓶定容至50mL，采用EDTA滴定上清液中游離鈣含量。

1.2.5 肽鈣復(fù)合物抗小腸刷狀緣膜酶（BBMV）實(shí)驗(yàn) 抗小腸刷狀緣膜酶實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。小腸刷狀緣膜酶的制備參考文獻(xiàn)[10]的方法，制得的懸浮液通過堿性磷酸酶（AKP）活性的測定及富集系數(shù)來確定是否可用，AKP酶活通過南京建材生物公司的堿性磷酸酶試劑盒測定。將魚鱗肽鈣復(fù)合物溶解在pH7.8的Tris-HCl緩沖液制成1%的溶液，加入10mL BBMV 37℃條件下分別于消化0.5、1、2、3、4h時取出樣品，沸水中加熱5min滅酶，冷卻至室溫，無水乙醇沉淀，測定上清液中游離鈣含量。

1.2.6 共存食物成分的抗干擾實(shí)驗(yàn) 將魚鱗肽鈣復(fù)合物配制成1%（w/v）的溶液，分別添加0、0.2%、0.4%、0.8%、4%、8%的NaCl、乳糖，用無水乙醇沉淀的方法，EDTA滴定上清液中游離的鈣含量。

1.2.7 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將魚鱗肽鈣復(fù)合物分別溶解在pH2.0的Clark-Lubs緩沖液、pH7.4的Tris-Hcl緩沖液、pH9.0的Clark-Lubs緩沖液中配成1%（w/v）的溶液，37℃下振搖2h后無水乙醇沉淀，測定上清液中游離鈣含量。

1.2.8 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將魚鱗蛋白肽鈣復(fù)合物配制成1%（w/v）的溶液，50、60、70、80℃水浴10、20、30min后取出樣品，冷卻至室溫，測定上清液中游離鈣含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鱗肽及肽鈣復(fù)合物基本成分分析

魚鱗肽中，粗蛋白含量較高，鈣含量較低（表2），而魚鱗肽鈣復(fù)合物中蛋白含量與鈣含量均較高。魚鱗肽鈣復(fù)合物中的鈣含量顯著高于魚鱗肽中的鈣含量（p＜0.05），與葡萄糖酸鈣中的鈣含量（9%）相當(dāng)，但低于乳酸鈣（13%）、檸檬酸鈣（21%）和碳酸鈣（40%）中的鈣含量。

表2 魚鱗肽及肽鈣復(fù)合物成分分析Table.2 The proximate analysis of fish scale hydrolysates and peptide-calcium complex

表3 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后肽鈣復(fù)合物的鈣結(jié)合量Table.3 The calcium binding activity of peptide-calcium complex after digestion by pepsin and trypsin

2.2 魚鱗肽鈣復(fù)合物抗消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

肽鈣復(fù)合物穩(wěn)定性受消化酶作用的影響結(jié)果見表3。隨著胃蛋白酶作用時間的延長，鈣結(jié)合量下降，肽的持鈣能力降低，但胃蛋白酶作用1、2h時與不添加胃蛋白酶pH2.0的處理比較，三者之間無顯著差異（p＞0.05）。表明肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合能力降低的原因可能與環(huán)境pH的改變相關(guān)，而受消化酶自身的影響較小。胃蛋白酶消化結(jié)束，改變環(huán)境的pH，鈣結(jié)合量升高，胰蛋白酶作用1h與2h時，二者之間無顯著性差異（p＞0.05）。體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)表明，肽鈣復(fù)合物經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，仍保留了消化酶作用前的68.16%的持鈣能力，證明了肽鈣復(fù)合物具有一定的抗消化性。

2.3 魚鱗肽鈣復(fù)合物抗小腸刷狀緣膜酶（BBMV）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

食物蛋白質(zhì)被分解成小肽供人體吸收是在小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜上完成的，這層刷狀緣膜覆蓋著小腸的整個表面，含有大量的水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，如肽鏈內(nèi)切酶、羧肽酶、二肽酶、氨肽酶等[11-12]，而這些水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)又是蛋白質(zhì)或肽被消化吸收時必不可少的工具。本實(shí)驗(yàn)中制備的小腸刷狀緣膜勻漿液中AKP酶活為0.859U/g蛋白，BBMV中AKP酶活為12.1U/g蛋白，富集系數(shù)14倍。肽鈣復(fù)合物的抗小腸刷狀緣膜酶的結(jié)果見圖1。魚鱗肽鈣復(fù)合物經(jīng)BBMV消化水解2h后，肽鈣復(fù)合物中鈣結(jié)合量為74.8mg/g，保留了79.9%的活性。消化3h與4h的鈣結(jié)合量相比，二者之間差異不顯著（p＞0.05）。表明，魚鱗肽鈣復(fù)合物對小腸刷狀緣膜酶有一定的耐受性。

2.4 共存食物成分NaCl、乳糖對魚鱗肽鈣復(fù)合物的穩(wěn)定性研究

圖1 BBMV處理對魚鱗蛋白肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量的影響Fig.1 Effect of BBMV on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

影響人體鈣吸收的因素除了機(jī)體狀態(tài)、腸道pH外，膳食因素也是影響人體鈣吸收的一個重要條件。據(jù)Marie-Anne研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物在腸道中發(fā)生酵解，可以降低腸道pH，減少鈣在堿性條件下沉淀，進(jìn)而促進(jìn)鈣的吸收。攝入過多的食鹽會增加尿鈣的排出，抑制鈣的吸收[13]。本實(shí)驗(yàn)通過添加不同濃度的乳糖、食鹽考察了可能存在的食物成分在體外環(huán)境下對肽鈣復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。圖2結(jié)果表明，隨著氯化鈉濃度的提高，魚鱗肽鈣復(fù)合物中鈣含量之間變化不明顯（p＞0.05），圖3中乳糖的添加也有類似結(jié)果（p＞0.05）。推測食物成分乳糖、氯化鈉可能是通過改變腸道環(huán)境進(jìn)而影響鈣的吸收，而在體外環(huán)境下對肽鈣復(fù)合物的影響不大。

2.5 魚鱗蛋白肽鈣復(fù)合物的酸堿穩(wěn)定性研究

圖2 NaCl對魚鱗肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量的影響Fig.2 Effect of NaCL on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

圖3 乳糖對魚鱗肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量的影響Fig.3 Effect of lactose on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

肽鈣復(fù)合物酸堿穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，肽鈣復(fù)合物在酸性條件下易解離，pH2.0時肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量（40.67mg/g）相比樣品（93.6mg/g）顯著性降低（p＜0.05）。這可能是因?yàn)樗嵝詶l件下H+與鈣離子之間存在競爭，使鈣離子結(jié)合量減少。在pH7.4的緩沖溶液中，鈣的結(jié)合量為62mg/g，顯著升高（p＜0.05）；在pH9.0的緩沖體系中，鈣的結(jié)合量達(dá)到（89.65mg/g），與樣品（93.6mg/g）相比無顯著性差異。推測鈣離子結(jié)合量的增加可能與pH的升高，H+濃度的減少，鈣離子與NH3+和COOH-之間的作用增強(qiáng)有關(guān)。表明魚鱗肽鈣復(fù)合物在酸性條件下較易裂解，而在弱堿環(huán)境下可以保持一定的穩(wěn)定性，抑制鈣離子產(chǎn)生沉淀。

圖4 pH對魚鱗肽鈣復(fù)合物鈣結(jié)合量的影響Fig.4 Effect of pH on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

2.6 熱穩(wěn)定性研究

熱處理是食品加工中常用的方式，為驗(yàn)證肽鈣復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，本研究考察了不同熱處理溫度和不同熱處理時間對肽鈣復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，隨著熱處理溫度的升高和熱處理時間的延長，鈣的結(jié)合量均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢（p＜0.05）（圖5）。80℃加熱30min后，復(fù)合物鈣的結(jié)合量降低到43.67mg/g，損失率達(dá)53.4%，其原因可能與熱處理破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)與鈣離子結(jié)合能力下降有關(guān)。

圖5 加熱時間對魚鱗肽鈣鈣結(jié)合量的影響Fig.5 Effect of heating time on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

3 結(jié)論

羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物對消化酶和小腸刷狀緣膜酶具有一定的耐受性，對共存食物成分具有一定的穩(wěn)定性，在酸性條件下復(fù)合物的鈣結(jié)合量較低，在腸道的弱堿環(huán)境下鈣的結(jié)合量提高。魚鱗肽鈣復(fù)合物阻止了鈣在弱堿性條件下的沉淀，更有利于鈣在吸收部位的穩(wěn)定，是一種極具潛力的肽鈣補(bǔ)充劑產(chǎn)品。

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Study on the stability of peptide-calcium complex from tilapia scale protein hydrolysates

NIE Rui-yan，LIU Yue-jiao，LIU Min，LIU Zun-ying*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The stability of peptide-calcium complex from tilapia scale protein hydrolysates was investigated by in vitro simulated gastrointestinal digestion，the resistance of small intestinal brush border membrane，coexistence of food composition，pH，heat treatment and other factors.Results showed that the tilapia fish peptide-calcium complex had high tolerance to the degradation of digestive enzymes and the small intestinal brush border membrane，but was sensitive to heat treatment，and the calcium-binding activity was decreased significantly when the temperature up to 50℃（p＜0.05）.With NaCl and lactose treatment，peptide-calcium complex maintained a good stability and had a combining rate of 89.65%under pH9.0.The results suggested tilapia scale peptide and calcium mainly existed in the form of the peptide-calcium complex in the small intestine to prevent calcium precipitation under alkaline conditions.

tilapia；fish scale；peptide-calcium complex；stability

TS254.9

A

1002-0306（2014）04-0088-04

2013－06－13 *通訊聯(lián)系人

聶瑞艷（1987-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31101379）。