胡 霞 王 蓉 李菲菲 周 濤 楊文才

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

自20世紀(jì)90年代我國發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒?。═YLCV）以來，該病害已遍布我國番茄主產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重威脅我國的番茄生產(chǎn)（葉青靜 等，2009；李小靖和葉志彪，2010；李常保 等，2012；吳篆芳 等，2013）。盡管利用殺蟲劑等方法能在一定程度上控制該病毒傳播者——煙粉虱的數(shù)量，但是經(jīng)常施用殺蟲劑會使煙粉虱產(chǎn)生抗藥性（Horowitz et al.，2007），也會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染（Palumbo et al.，2001）。采用細(xì)孔網(wǎng)或者紫外吸收塑料膜遮蓋等物理方法（Cohen ＆ Antignus，1994）起到了一定的防治效果，然而這些物理防治方法不能保證正常的光照，還會形成高溫高濕的環(huán)境，影響番茄植株的正常生長。利用植物自身的抗性基因是防治TYLCV 最有效的方法（Morales，2001；Lapidot ＆Friedmann，2002）。

番茄在生長發(fā)育過程中除受到多種病毒侵染外，還會同時受到諸如斑點病、瘡痂病和潰瘍病等細(xì)菌性病害的危害，培育抗多種病害的品種一直是番茄育種的目標(biāo)（杜永臣 等，1999）。采用常規(guī)育種方法難以在田間進(jìn)行抗單一病害材料的篩選，分子標(biāo)記輔助選擇為解決這一難題提供了可能。Sun等（2011）根據(jù)番茄斑點病抗性基因Pto位點在抗感病材料中的序列差異建立的InDel 標(biāo)記和Pei 等（2012）利用番茄瘡痂病抗性基因Rx4位點在抗感材料中的序列差異建立的InDel 標(biāo)記都是功能基因分子標(biāo)記，能夠?qū)共€體進(jìn)行準(zhǔn)確的選擇。而對于尚未克隆的抗性基因，則可選擇與基因最緊密連鎖的標(biāo)記，以提高選擇的準(zhǔn)確性，如Yang 和Francis（2005）利用與番茄瘡痂病抗性位點Rx3緊密連鎖的標(biāo)記成功地將Rx3和Pto兩個基因聚合到同一材料中，育成抗番茄斑點病和瘡痂病的材料。從1994年至今，人們已經(jīng)開發(fā)了與5個抗TYLCV基因Ty-1～Ty-5緊密連鎖的可用于抗性基因選擇的分子標(biāo)記（楊曉慧 等，2012），但這些標(biāo)記在實際應(yīng)用中都存在一些問題，如檢測太復(fù)雜、穩(wěn)定性和可靠性不高等。番茄基因組的出現(xiàn)以及抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3的克隆，為開發(fā)穩(wěn)定可靠且檢測簡單易行的標(biāo)記提供了可能。因此，本試驗的目的是開發(fā)可用于準(zhǔn)確選擇Ty-1/Ty-3和Ty-4的分子標(biāo)記，并將抗病毒病基因與抗細(xì)菌病害基因聚合，培育抗多個病害的育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用于標(biāo)記輔助選擇的番茄（SolanumlycopersicumL.）親本有10個，OH 9242 和里格爾87-5 分別是美國和我國廣泛種植的兩個加工番茄品種，但缺少抗TYLCV 的基因；IBL 2361 和ZN 17是兩個育種中間材料；另有6 份材料分別作為不同病害抗性基因的供體（表1）。將這些材料配制一些雜交組合，加代得到F2群體，供標(biāo)記輔助選擇用。

2013年6月28日將F2種子播種于288 孔育苗盤中，育苗基質(zhì)為2V草炭∶1V蛭石。從幼苗上取幼嫩葉片提取DNA 供標(biāo)記輔助選擇使用。2013年8月9日，將選出的與抗病親本帶型相同的F2單株定植到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站日光溫室，收獲F2：3種子。將F2：3種子用4%次氯酸鈉消毒5 min，并用去離子水漂洗3～4次，干燥后保存?zhèn)溆谩?014年1月23日播種F2：3種子。待幼苗長出2～3片真葉時，取幼嫩葉片提取DNA，供標(biāo)記選擇和驗證使用。挑選抗性基因位點純合的單株于2014年3月5日移栽到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園溫室，進(jìn)行抗性鑒定。

表1 所用抗病親本及標(biāo)記信息

1.2 抗TYLCV 新標(biāo)記設(shè)計

為了獲得穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記，本試驗根據(jù)已經(jīng)克隆的Ty-1和Ty-3基因（Verlann et al.，2013）位點在抗感品種中的序列差異設(shè)計引物，獲得了功能基因分子標(biāo)記Ty1-3。該標(biāo)記是一個InDel 標(biāo)記，從抗病材料中擴(kuò)增到的片段大小為209 bp，從感病材料中擴(kuò)增到的片段大小為197 bp。同時根據(jù)Ji 等（2009）報道的Ty-4在染色體上的位置，選擇與其最緊密連鎖的標(biāo)記C2_At4g173000，從抗感材料中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和序列分析，發(fā)現(xiàn)在抗感材料中序列長度不同，據(jù)此設(shè)計了InDel 標(biāo)記，命名為CAUTy4。該標(biāo)記從抗病材料中擴(kuò)增到的片段大小為219 bp，從感病材料中擴(kuò)增到的片段大小為214 bp。原來的C2_At4g173000 是一個CAPs 標(biāo)記（Ji et al.，2009），需要經(jīng)過PCR、酶切、電泳等過程進(jìn)行基因型檢測，新設(shè)計的兩個InDel 標(biāo)記都只需要PCR 和凝膠電泳即可完成基因型檢測。

1.3 標(biāo)記輔助選擇策略

采用堿裂解法（Yang ＆ Francis，2005）提取番茄植株基因組DNA。鑒于有些雜交組合涉及到選擇3個或3個以上抗性基因，為了減少工作量，本試驗首先用一個功能基因標(biāo)記對相應(yīng)F2群體的所有植株進(jìn)行篩選，只有攜帶純合抗性基因位點的植株才被用于篩選第2個基因，依此類推。由于有些群體單株數(shù)不夠多，沒有能夠獲得所有基因位點都純合的個體，因此保留了部分基因位點雜合的單株供F2：3繼續(xù)選擇。

番茄瘡痂病T1 小種抗性位點Rx3的標(biāo)記檢測參考Yang 和Francis（2005）的方法，番茄瘡痂病T3 小種抗性位點Rx4的功能基因標(biāo)記檢測參考Pei等（2012）的方法，番茄斑點病抗性基因Pto的功能基因標(biāo)記檢測參考Sun 等（2011）的方法，番茄潰瘍病抗性位點Cmm2.0的標(biāo)記檢測參考Coaker 和Francis（2004）的方法，抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3和Ty-4的檢測采用如下方法。

PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2 μL（約10 ng）DNA模板、3.4 μLTaq10 2×Master Mix（北京奧賽博科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）、0.3 μL 10 μmol·L-1正向引物、0.3 μL 10 μmol·L-1反 向引物和4 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件為：94℃變性5 min，38個循環(huán)的94℃變性45 s、55℃退火45 s和72℃延伸45 s，最后一步反應(yīng)在72℃下保持5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色顯帶后，記錄每個單株的基因型。

1.4 抗TYLCV 鑒定

從F2中選出的單株定植到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站日光溫室后自然發(fā)病，觀察并記載發(fā)病情況。F2∶3家系采用人工注射接種在日光溫室內(nèi)進(jìn)行抗性鑒定，病毒所屬株系來自上海的TYLCVSH2，接種后28 d 和42 d 各調(diào)查一次。病害分級參考Friedmann 等（1998）的方法進(jìn)行：0級—接種和沒接種的植株一樣，沒有感病癥狀，能夠正常生長；1級—頂端葉片（葉邊緣）出現(xiàn)輕微泛黃；2級—葉片末端有些泛黃和輕微卷曲；3級—大面積葉片變黃，影響更為嚴(yán)重，新葉面積減少，但植株可以繼續(xù)生長；4級—植物生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響，葉片基本變黃，甚至變紫，杯狀卷曲，停止生長。將0～2級劃分為抗病，3～4級劃分為感?。↗i et al.，2009）。

由于少數(shù)入選的F2：3家系群體較小，因此將來自于同一個F2群體的不同F(xiàn)2：3家系算作一個群體，按100×∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）進(jìn)行病情指數(shù)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗TYLCV基因新標(biāo)記的可靠性分析

為了檢驗新設(shè)計的用于選擇抗TYLCV基因標(biāo)記的可靠性，本試驗用Ty1-3 和CAUTy4 這兩個標(biāo)記分析了10 份攜帶Ty-1、Ty-3、Ty-4中1個或多個基因的番茄材料和1 份新的抗病材料LA 1589 的基因型，以感病品種OH 88119 作為對照。結(jié)果顯示，兩對引物擴(kuò)增得到的基因型與材料所攜帶的已知抗性基因完全一致（表2、圖1），表明用這兩個標(biāo)記來檢測各自的基因型是準(zhǔn)確可靠的。同時也發(fā)現(xiàn)，新的抗性材料LA 1589 不含有Ty-1、Ty-3和Ty-4基因中的任何一個。

表2 12 份番茄材料經(jīng)標(biāo)記Ty1-3 和CAUTy4 檢測的基因型及其攜帶的抗性基因

圖1 普通PCR和多重PCR的電泳對比

2.2 標(biāo)記Ty1-3和CAUTy4的多重PCR體系建立

為了提高檢測效率，本試驗嘗試構(gòu)建Ty1-3 和CAUTy4 這兩個標(biāo)記的多重PCR 體系，在PCR 體系中同時加入兩個標(biāo)記的引物，對上述12 份材料的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示（圖1），兩對引物單獨使用時都能從12 份材料中擴(kuò)增出清晰的條帶，同時使用兩對引物擴(kuò)增時，兩對引物的PCR 產(chǎn)物條帶依然清晰，表明這兩個標(biāo)記可以用多重PCR 進(jìn)行檢測。

2.3 不同抗性基因的聚合選擇和抗TYLCV 的鑒定結(jié)果

采用功能基因標(biāo)記Ty1-3 對8個雜交組合（表3）的F1進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所有F1植株都帶有各自親本的條帶，為雜合型，表明所有單株都是真雜種，為獲得用于標(biāo)記輔助選擇的F2群體提供了保障。

根據(jù)不同雜交組合所選擇基因的需要，確定了每個F2群體的播種種子數(shù)，但由于出苗等原因，有些群體沒有足夠的苗供篩選所有抗性基因位點都純合的個體，因此在實際篩選時保留少量雜合的基因型，8個組合共獲得了57個單株（表3）。

表3 各組合標(biāo)記選擇獲得植株數(shù)和抗性鑒定結(jié)果

將這57個單株于2013年8月9日定植到日光溫室里，植株在生長過程中受到了煙粉虱為害，植株自然發(fā)生TYLCV 病害。調(diào)查顯示，所有單株的TYLCV 病級都在0～2 之間，表現(xiàn)出了較好的抗性，并能正常開花坐果，特別是從FG 02-7530×Gc 171組合中選出的4個單株，植株生長健壯，沒有任何發(fā)病癥狀（圖2-A）。而同時種植在該日光溫室里的不帶抗性基因的材料則表現(xiàn)出TYLCV 的典型癥狀，葉片向上卷曲，葉片黃化，植株矮小，生長極其緩慢，不能開花坐果（圖2-B）。

圖2 FG 02-7530×Gc 171 組合入選植株和不帶抗TYLCV基因的植株自然發(fā)病情況

對從F2群體中選出的部分一個位點純合而另外位點雜合的單株F2：3家系進(jìn)行了標(biāo)記輔助選擇，連同從F2中選出的純合單株，共得到21個F2：3家系582個單株，包括4個攜帶5個抗性基因的家系、9個攜帶3個抗性基因的家系、2個攜帶2個抗性基因的家系和6個攜帶1個抗性基因的家系（表3）。

由于接種TYLCV后的兩次調(diào)查結(jié)果基本一致，因此這里只用了接種42 d后的病級及病情指數(shù)。接種42 d后，所有單株的病級都在0～2 之間，其中0級的占88.0%，1級的占8.2%，2級的占3.8%。表明采用標(biāo)記選出的所有單株對所用的病毒株系都具有抗性。

從里格爾87-5×Gc 171 組合中選出兩種類型的家系，一種只帶Ty-1/Ty-3基因，另一種攜帶Ty-1/Ty-3和Ty-4基因。前者共有60個單株，其中22個為0級，18個為1級，20個為2級，病情指數(shù)為24.2。后者共41個單株，包括16個0級，24個1級和1個2級，病情指數(shù)為15.9，而且這兩個家系的病情指數(shù)都明顯高于其他家系（表3）。

3 結(jié)論與討論

用于聚合育種的分子標(biāo)記必須具有檢測的可靠性和操作的簡單性，這樣才能快速準(zhǔn)確地選到目標(biāo)基因。根據(jù)已經(jīng)克隆的基因在功能區(qū)域的序列差異設(shè)計標(biāo)記，是獲得較為可靠的功能基因分子標(biāo)記的途徑之一。已有的抗TYLCV基因定位研究表明，抗性基因Ty-1和Ty-3都位于6號染色體上（Zamir et al.，1994；Ji et al.，2007），進(jìn)一步的研究指出，Ty-1和Ty-3為等位基因（Verlaan et al.，2013）。本試驗依據(jù)已經(jīng)克隆的TYLCV基因Ty-1和Ty-3與感病材料中對應(yīng)基因的序列差異設(shè)計引物，建立了功能基因分子標(biāo)記Ty1-3。用該標(biāo)記對Zamir 等 （1994）報道的攜帶Ty-1基因的材料LA 3473 進(jìn)行基因型分析，結(jié)果顯示其條帶與攜帶Ty-3材料的條帶一致，也驗證了Ty-1和Ty-3是等位基因。由這個標(biāo)記選擇的單株都具有很好的抗病性，表明該標(biāo)記的確為功能基因分子標(biāo)記，可用于對這兩個基因的選擇。而Ji 等（2009）報道的與Ty-4基因緊密連鎖的標(biāo)記是CAPs 標(biāo)記，需要經(jīng)過PCR、酶切等相對復(fù)雜的過程，本試驗中根據(jù)該標(biāo)記在抗感材料中的序列差異設(shè)計成InDel 標(biāo)記，只需要PCR 即可，簡化了檢測過程。用兩個新設(shè)計的標(biāo)記篩選相應(yīng)的基因，所得到的植株都表現(xiàn)出很好的抗性，表明這兩個新標(biāo)記是可靠的。

利用不同的材料將不同的抗性基因聚合到同一個材料中，能夠增加番茄材料抗病毒生理小種的范圍，大大提高植株對病害的抗性，使其抗性更加穩(wěn)定 持 久（Banerjee & Kallo，1987；Vidavski et al.，2008）。Mejía 等（2005）利用不同的番茄材料在危地馬拉進(jìn)行抗病性評估，含有純合Ty-2基因型的材料在當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)為感病，含有Ty-2和Ty-3a雜合基因型的材料表現(xiàn)抗病。另外，含有雜合基因型Ty-2和Ty-3a的材料比只含Ty-3純合基因型的材料表現(xiàn)出更高的抗性水平。在本試驗中，無論是只含有Ty-1，或者Ty-1和Ty-3，還是同時含有Ty-1、Ty-3和Ty-4的材料，對所用的病毒菌株都具有較好的抗性。但在不同的遺傳背景下抗性略有差異，當(dāng)以FG 02-7530、IBL 2353、IBL 2361、OH9242、ZN 17、WGH12-3032 等為受體材料時，所得到的植株都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性，而以里格爾87-5 為受體時，后代中無論是攜帶Ty-1/Ty-3基因還是同時攜帶Ty-1/Ty-3和Ty-4基因的植株，其抗性都比其他材料的略差，不過同時攜帶Ty-1/Ty-3和Ty-4基因的植株抗性要好于只攜帶Ty-1/Ty-3基因的植株。這些結(jié)果表明，遺傳背景對抗性基因的表達(dá)可能有一定的影響。

群體大小是影響多基因聚合育種效率的因素之一，聚合效率隨著群體中個體數(shù)的增加而加大，如果基礎(chǔ)群體太小，就有可能得不到所需要的純合基因型個體。本試驗根據(jù)每個F2群體所聚合的基因數(shù)目確定的播種量播種，但由于種子發(fā)芽率偏低（種子收獲于2012年12月），因此8個F2群體中有6個沒有達(dá)到預(yù)期的供選植株數(shù)，導(dǎo)致從群體中選擇所有基因位點都純合的單株數(shù)偏少，在5個聚合2～5個基因的F2群體中只有2.7%的單株在所有基因位點都表現(xiàn)為純合型。為了獲得更多在所有位點都純合的單株，在實際選擇時保留了一些雜合基因型個體供F2：3進(jìn)一步選擇，這樣做雖然最終獲得了所有位點都純合的基因型個體，但增加了世代數(shù)和選擇成本，降低了聚合效率。因此，在進(jìn)行聚合育種時，可先檢測種子的發(fā)芽率，然后結(jié)合聚合的基因數(shù)確定播種量，以便充分發(fā)揮分子標(biāo)記聚合育種的優(yōu)勢。

本試驗所用的番茄材料涉及到斑點病、瘡痂病、潰瘍病和TYLCV，但僅對所選到的植株進(jìn)行了抗TYLCV 的鑒定。原因在于選擇番茄斑點病抗性基因Pto和瘡痂病抗性基因Rx4用的是功能基因分子標(biāo)記，這兩個基因的功能分子標(biāo)記已經(jīng)被證實可直接用于抗性基因的選擇（Yang & Francis，2005；Pei et al.，2012）。瘡 痂 病 抗 性位點Rx3和潰瘍病抗性位點Cmm2.0是兩個尚未被克隆的QTL，但是已有的研究表明，利用與Rx3位點緊密連鎖的標(biāo)記可準(zhǔn)確選擇到攜帶該位點的抗性單株（Yang & Francis，2005；張曉敏 等，2009），而利用與Cmm2.0緊密連鎖的標(biāo)記也可準(zhǔn)確獲得抗?jié)儾〉膯沃辏–oaker & Francis，2004）。鑒于本試驗所用的抗性材料和分子標(biāo)記與文獻(xiàn)中（Coaker & Francis，2004；Yang & Francis，2005；張曉敏 等，2009；Pei et al.，2012）的相同，因此推測本試驗所選的攜帶抗性基因的材料即為抗病材料。

綜上所述，本試驗開發(fā)了抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3和Ty-4的新標(biāo)記，并建立了多重PCR 體系。通過雜交結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，將抗TYLCV、斑點病、瘡痂病、潰瘍病等的基因分別聚合，獲得了7份兼抗斑點病、TYLCV 和瘡痂病的材料，6 份攜帶多個TYLCV基因（Ty-1/Ty-3和Ty-4）的材料，以及1 份兼抗TYLCV 和潰瘍病的材料，為番茄抗多個病害分子標(biāo)記聚合育種提供了材料。

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