張勇

（巴州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川巴中 636000）

利福昔明對家兔腸道菌群的影響

張勇

（巴州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川巴中 636000）

本實驗就利福昔明對家兔腸道菌群的影響進行了研究。將利福昔明按25、50、100mg/kg三個劑量組分別給40日齡家兔口服，連續(xù)用藥3d，并于首次用藥后第4、7、10d剖殺家兔，取盲腸和回腸內(nèi)容物進行乳酸桿菌和大腸桿菌的選擇性培養(yǎng)并計數(shù)，以此評價利福昔明對家兔腸道菌群數(shù)量的影響。結(jié)果顯示：利福昔明高、中、低劑量組對回腸和盲腸的大腸桿菌菌群數(shù)目與空白對照組相比數(shù)量減少，其中，高劑量組(100mg/kg)在首次用藥后第7、10d對家兔回腸大腸桿菌影響差異顯著(P＜0.05)。利福昔明高、中、低劑量組對回腸和盲腸的乳酸桿菌與空白對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

利福昔明；乳酸桿菌；大腸桿菌；家兔

利福昔明（Rifaximin）為半合成廣譜腸道抗生素，是目前用于腸道細菌感染的利福霉素衍生物類抗生素，對革蘭氏陽性菌及陰性菌都有強大的殺滅作用[1]，抗菌活性很強。

正常腸道微生物菌群是在動物內(nèi)環(huán)境中定居、繁殖的一類菌群，在動物處于健康狀態(tài)時不表現(xiàn)出異?；蛑虏‖F(xiàn)象。這些正常菌群在動物機體內(nèi)構(gòu)成了一道天然屏障，是動物機體內(nèi)環(huán)境中不可缺少的組成部分，它對維持腸道內(nèi)正常的微生態(tài)環(huán)境，抵御其它致病菌或潛在致病菌的入侵等方面起著重要作用[2]。乳酸桿菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌等是動物機體內(nèi)的正常菌群[4]，廣泛分布于動物的腸道中。研究顯示，家兔盲腸里乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量較為可觀并且穩(wěn)定[3]。因此，本試驗選擇盲腸和回腸作為檢測乳酸桿菌的腸段，初步研究利福昔明對家兔正常菌群的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

SW-CJ-JC型超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平、移液器。

1.1.2 試劑

利福昔明原粉（含量99.9%）、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS）、伊紅美蘭瓊脂（EMB）、磷酸鹽稀釋液。

1.1.3 實驗動物

40周齡未經(jīng)任何疫苗免疫家兔60只，雌雄各半，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食及飲水。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與處理

將35日齡家兔隨機分成低、中、高和空白對照組，每組15只，40日齡時將利福昔明以低、中、高三個劑量組分別以25、50、100mg/kg灌服，2次/d，連用3d?？瞻讓φ战M灌服等量生理鹽水。

1.2.2 樣品采集與處理

分別在首次用藥后的第4d、第7d、第10d早晨每組隨機取5只家兔處死后，立即打開腹腔，按組織學(xué)區(qū)分并結(jié)扎各腸段，在回腸和盲腸入口處用細線緊緊扎住，然后將扎口的盲腸取下來，保持盲腸內(nèi)容物與外界隔絕，防止污染，用于測定內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸桿菌含量。同樣方法取靠近盲腸的回腸段。

1.2.3 樣品稀釋

在超凈臺中取兩腸段靠近黏膜部位的內(nèi)容物，取1.0g腸內(nèi)容物于無菌試管內(nèi)，加入無菌稀釋液9 mL經(jīng)振蕩器振蕩至混勻，靜置一段時間，然后從中吸取上清液1.0mL放入盛有9mL稀釋液的第二個試管中進行10-2稀釋，振蕩混勻，以此類推，將梯度稀釋到10-7。

1.2.4 接種與培養(yǎng)

取10-3、10-4、10-5稀釋度的菌液各20μL接種于大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基(EMB)上；取10-5、10-6、10-7稀釋度的菌液各50μl接種于乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(LBS)上，每個稀釋度各接種3個平皿，EMB平皿37℃培養(yǎng)24h，LBS平皿37℃培養(yǎng)48h。根據(jù)選擇性培養(yǎng)基、菌落形態(tài)、顏色及革蘭氏染色特點鑒定細菌，選擇具有可數(shù)性稀釋度的平板(以長100～200個菌落為宜)，根據(jù)菌落可數(shù)性原則，即1個細菌產(chǎn)生1個菌落，對2種微生物進行平板菌落計數(shù)，求其平均值并計算每克腸道內(nèi)容物所含細菌數(shù)。以每克腸道內(nèi)容物中細菌個數(shù)的對數(shù)(lgcfu/g)表示。計算公式如下：每克盲容物菌落數(shù)的對數(shù)=log10(菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣毫升數(shù))/(接種用樣品毫升數(shù)×樣品克數(shù))[5]。 1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS(Ver.19.0)軟件進行統(tǒng)計分析。試驗組與對照組之間的差異采用單因子方差(One-Way Anova)分析。多重比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離

大腸桿菌在EMB培養(yǎng)基上生長良好,菌落呈紅色,表面光滑,低凸,邊緣整齊,有光澤。鏡檢為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓的短桿狀。乳酸桿菌在LBS培養(yǎng)基上生長良好，為小的乳白色稍有突起的菌落，中央呈乳突狀隆起，邊緣不整齊，鏡檢革蘭氏染色為陽性，呈紫色細小彎曲的鏈狀或排列成柵。

2.2 對家兔腸道菌群的影響

表1 家兔每克腸內(nèi)容物菌群數(shù)的對數(shù) lg CFU/g

由表1可以看出，利福昔明高、中、低劑量組對回腸和盲腸的大腸桿菌菌群數(shù)目與空白對照組相比數(shù)量減少，其中，高劑量組在首次用藥后第7d和第10d對回腸大腸桿菌影響差異顯著(P＜0.05)，其他各劑量組無顯著差異(P＞0.05)；利福昔明高、中、低劑量組對回腸和盲腸的乳酸桿菌與空白對照組相比整體數(shù)量有增加的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

動物機體內(nèi)正常菌群彼此之間保持著動態(tài)平衡，是動物機體內(nèi)十分重要的非特異性防御屏障。腸道中正常菌群與宿主的正常生理功能有著密切的關(guān)系，對某些入侵的病原微生物具有明顯的拮抗作用。大腸桿菌和乳酸桿菌為腸道中正常菌群，其中乳酸桿菌可產(chǎn)生類抗生素物質(zhì)、乳酸等，并降低腸道pH值，既可抑制病原微生物的生長繁殖，又能促進腸道中其它厭氧菌的生長繁殖。本試驗中測得的對照組大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量與多起實驗報道的盲腸和回腸中大腸桿菌的數(shù)目基本吻合,但整體分析用藥后大腸桿菌的數(shù)目下降，乳酸桿菌的數(shù)目上升。這表明，乳酸菌作為腸道菌群的一部分，其作為益生素菌種在腸道內(nèi)生長繁殖，對腸道內(nèi)有益微生物有一定的助生長作用，而對致病菌則有一定拮抗作用，能夠有效改善腸道環(huán)境。

利福昔明口服不吸收并對厭氧菌有極強的殺滅作用，將其與金霉素進行隨機、雙盲對照研究以比較它們治療腸道菌群失調(diào)的有效性和安全性，結(jié)果表明，利福昔明是治療小腸細菌過度生長、維持腸道菌群平衡安全、有效的藥物[5,6]。

本實驗結(jié)果證實利福昔明對家兔腸道內(nèi)益生菌乳酸桿菌數(shù)量沒有明顯影響，但能夠削弱致病菌大腸桿菌的繁殖能力，幫助機體確立腸道益生菌群的優(yōu)勢地位，并建立穩(wěn)態(tài)正常菌群，增強動物機體免疫能力，從而預(yù)防雛家兔的消化道疾病。

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