張子陽，阮成龍，繆元穎

（1.重慶永川區(qū)公安局刑警支隊(duì)，重慶402160；2.重慶市刑警總隊(duì)DNA室，重慶400000）

微量混合脫落細(xì)胞擴(kuò)增和電泳時(shí)間的影響

張子陽1，阮成龍1，繆元穎2

（1.重慶永川區(qū)公安局刑警支隊(duì)，重慶402160；2.重慶市刑警總隊(duì)DNA室，重慶400000）

當(dāng)前犯罪現(xiàn)場約52%的法醫(yī)學(xué)物證,為微量脫落細(xì)胞的生物檢材。研究微量混合脫落細(xì)胞生物檢材提取后擴(kuò)增和電泳時(shí)間對檢測結(jié)果的影響。初步表明微量生物檢材隨著時(shí)間的推移，存在降解。

微量混脫落細(xì)胞；STR分型；法醫(yī)物證

1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffreys等用RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）的方法分析人基因組，檢測到多條譜帶，如同人的指紋一樣，具有高度的個(gè)體特異性，故稱之為“DNA指紋”技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)使傳統(tǒng)的法醫(yī)生物物證檢驗(yàn)只能排除發(fā)展到能進(jìn)行同一認(rèn)定的水平，這也是法醫(yī)學(xué)家們夢寐以求并且一直努力解決的問題。DNA指紋技術(shù)開辟了法醫(yī)物證檢驗(yàn)技術(shù)的新領(lǐng)域，但它也存在許多缺陷，尤其是在檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化上存在現(xiàn)實(shí)困難，以及對檢材條件要求較高等方面限制了其發(fā)展。近年來，隨著DNA多態(tài)性系統(tǒng)的大量增多，基于PCR技術(shù)的熒光法STR分型檢測技術(shù)，以其快速（一次復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)就基本達(dá)到認(rèn)定的水平）、靈敏度高（適合現(xiàn)場提取的微量檢材的檢驗(yàn)）、檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確（每個(gè)泳道內(nèi)都加入內(nèi)標(biāo)）、易于標(biāo)準(zhǔn)化和建立數(shù)據(jù)庫等優(yōu)點(diǎn)，逐漸代替了銀染法檢測技術(shù)[1]，成為法醫(yī)學(xué)上個(gè)體識別和親子鑒定的主要技術(shù)方法。利用熒光STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，除能對常染色體上的STR基因座進(jìn)行分析外，還可對X、Y染色體上的STR基因座及線粒體DNA進(jìn)行分析。

當(dāng)前我國犯罪現(xiàn)場約52%的法醫(yī)學(xué)物證，為含微量脫落細(xì)胞的生物檢材，微量脫落細(xì)胞主要為指印、皮膚脫落上皮細(xì)胞。其中皮膚占人體重量15%，是人體最大的器官。人皮膚每天大約脫落400,000個(gè)細(xì)胞，同時(shí)每平方厘米皮膚含有100個(gè)濕腺、10個(gè)油腺，能分泌大量代謝細(xì)胞。因此，在案件中對脫落細(xì)胞的檢測顯得尤為重要。

一、材料與方法

（一）樣本

本地區(qū)入室盜竊案中實(shí)物提取檢材。采用干濕兩步法棉簽擦拭提取脫落細(xì)胞，其中USB線標(biāo)記為1872，電源線標(biāo)記為1873-yuan。

（二）試劑和儀器

ABI-3130基因分析儀，ABI PCR擴(kuò)增儀，BACKMAN高速離心機(jī)，水浴鍋，提取、擴(kuò)增和檢測試劑盒均購自ABI公司。

（三）方法

1.按行標(biāo)GA/T383-2002中Chelex法提取檢材DNA。剪取擦拭棉簽表層置于0.5ml離心管內(nèi)。加入200ul純水，室溫浸泡，反復(fù)振蕩，13000rpm離心5min，棄上清，管底留約20ul液體及檢材基質(zhì)。加入100ul5%Chelex-100和1% PK，56℃水浴30min，100℃10min，13000rpm離心5mim，上清4℃冰箱內(nèi)備用。

2.采用Identifiler試劑盒復(fù)合擴(kuò)增DNA。標(biāo)準(zhǔn)的20ul PCR反應(yīng)體系：PCR MIX：8ul；引物：4ul；檢材DNA：8ul。擴(kuò)增參數(shù)：95℃11min 94℃20s 59℃3min R28 60℃10min 4℃

3.應(yīng)用ABI-3130型DNA基因分析儀電泳分離和激光掃描分析檢材STR基因分型。

二、結(jié)果

1.采用Chelex法提取1872號、1873-yuan號檢材DNA后，在1h和12h分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后1h進(jìn)行電泳，獲得的分型結(jié)果顯示：檢材提取后12h PCR擴(kuò)增有部分非主峰分型丟失（圖1-圖4）。

圖1 1872號檢材DNA提取后1h擴(kuò)增分型結(jié)果

圖2 1872號檢材DNA提取后12h擴(kuò)增分型結(jié)果

圖3 1873-yuan號檢材DNA提取后1h擴(kuò)增分型結(jié)果

圖4 1873-yuan號檢材DNA提取后12h擴(kuò)增分型結(jié)果

2.采用Chelex法提取1872號、1873-yuan號檢材DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后室溫保存，分別在1h和12h進(jìn)行電泳，獲得的分型結(jié)果顯示：檢材擴(kuò)增后12h電泳，部分峰值低于擴(kuò)增后1h電泳（圖5，圖6）。

圖5 1872號檢材DNA擴(kuò)增后12h電泳分型結(jié)果

圖6 1873-yuan號檢材DNA擴(kuò)增后12h電泳分型結(jié)果

三、討論

通過對實(shí)際案件中微量混合脫落細(xì)胞檢材的提取，在不同時(shí)間段進(jìn)行擴(kuò)增和電泳的方法，探討在實(shí)際檢測中，微量混合脫落細(xì)胞生物檢材提取后，時(shí)間對檢測結(jié)果的影響。分型結(jié)果顯示：微量混合脫落細(xì)胞檢材提取后1h PCR擴(kuò)增，效果優(yōu)于提取后12h擴(kuò)增；檢材擴(kuò)增后1h電泳優(yōu)于擴(kuò)增后12h電泳。初步表明：微量生物檢材隨著時(shí)間的推移，存在降解。雖然在12h內(nèi)不影響主峰的判斷，但仍應(yīng)盡早提取、擴(kuò)增和電泳分型。由于受案件、檢材等條件的限制，本實(shí)驗(yàn)的普遍性還需更多數(shù)據(jù)支持，同時(shí)存放12h以后的影響結(jié)果也有待進(jìn)一步研究。

早在我國古代法醫(yī)學(xué)家宋慈《洗冤集錄》記載的“滴骨驗(yàn)親法”就開始了法醫(yī)物證學(xué)的應(yīng)用。1900年，Landsteiner發(fā)現(xiàn)ABO血型后，開始用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。20世紀(jì)60年代電泳技術(shù)的建立，開始了“血清型和酶型”的檢驗(yàn)。英國遺傳學(xué)家Jeffreys教授等在1985年首先把DNA指紋技術(shù)用于法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，使法醫(yī)物證檢驗(yàn)學(xué)發(fā)生了一場革命，法醫(yī)檢驗(yàn)達(dá)到了同一認(rèn)定的水平。目前經(jīng)過20年的發(fā)展，法醫(yī)DNA分析技術(shù)已經(jīng)成為法醫(yī)物證學(xué)檢驗(yàn)的主要手段[2]。目前我國已建成了國家、省、市三級結(jié)構(gòu)模式運(yùn)行的“中國法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫”（簡稱DNA數(shù)據(jù)庫），主要包括基礎(chǔ)DNA數(shù)據(jù)庫，前科、現(xiàn)場庫，失蹤人員庫等[3]。數(shù)據(jù)庫利用公安網(wǎng)絡(luò)，將全國各地?cái)?shù)字化的DNA信息聯(lián)系起來，自動(dòng)查詢比對，真正實(shí)現(xiàn)資源共享，充分發(fā)揮DNA信息在查證身源和串并案件中的作用，提高了我國刑事科學(xué)技術(shù)在打擊犯罪中的快速反應(yīng)能力和震懾威力，為偵破案件、正確審理案件、加強(qiáng)法制化建設(shè)發(fā)揮了重要作用，更好地維護(hù)社會穩(wěn)定，履行公安工作的職能[4]。

[1]陳雨.刑事訴訟中的DNA鑒定問題研究[D].上海:上海交通大學(xué),2011.

[2]李莉,柳燕,何根蘭.法醫(yī)物證學(xué)DNA檢驗(yàn)現(xiàn)狀及展望[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2002(1).

[3]姜先華.中國法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫[J].中國法醫(yī)學(xué)精選,2006(5).

[4]姜先華.DNA分析技術(shù)在法庭科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展[J].現(xiàn)代儀器與醫(yī)療,2004(6).

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1673―2391(2014)08―0176―02

2014-05-05責(zé)任編校：李烽