黃靚張弛高勇強王漢群尹衛(wèi)東

1.心血管病研究所動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南衡陽421000；2.外科學總論及手術學教研室，湖南衡陽421000

Ibrolipim對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al表達及腫瘤壞死因子-α釋放的影響

黃靚1張弛1高勇強2王漢群2尹衛(wèi)東1

1.心血管病研究所動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南衡陽421000；2.外科學總論及手術學教研室，湖南衡陽421000

目的為探討巨噬細胞源性泡沫細胞腫瘤壞死因子-α的釋放與新藥Ibrolipim（NO-1886）抗動脈粥樣硬化作用的關系。方法采用體外培養(yǎng)的THP-1細胞構(gòu)建泡沫細胞模型，分別經(jīng)Ibrolipim處理6、12、24 h后，高效液相色譜法檢測細胞內(nèi)膽固醇含量的變化，雙抗體夾心法檢測細胞培養(yǎng)液腫瘤壞死因子-α的水平，免疫印跡法檢測細胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A l蛋白的表達。結(jié)果與對照組比較，泡沫細胞經(jīng)Ibrolipim處理6、12、24 h后，細胞內(nèi)總膽固醇含量和游離膽固醇含量不斷減少，細胞培養(yǎng)液中的腫瘤壞死因子-α水平逐漸降低，細胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A l蛋白的表達升高。結(jié)論Ibrolipim抗動脈粥樣硬化的作用與其減少泡沫細胞腫瘤壞死因子-α的釋放有關。

THP-1源性巨噬細胞；泡沫細胞；Ibrolipim；腫瘤壞死因子-α；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體

隨著動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）研究的深入，AS發(fā)病過程中炎癥反應機制及其調(diào)控引起了眾多學者的關注。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種重要的炎癥因子，在AS病變斑塊中主要由巨噬細胞和血管平滑肌細胞分泌，具有損傷內(nèi)皮細胞，刺激前炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶釋放，促進血管平滑肌細胞增殖和遷移的作用[1]。另外，研究發(fā)現(xiàn)用TNF和白細胞介素1共同處理細胞，可使細胞膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白三磷酸腺苷結(jié)合三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G l（ATP-binding cassette transporter G 1，ABCG l）、盒轉(zhuǎn)運體A l（ATP-binding cassette transporter A 1，ABCA l）表達減少。合成化合物Ibrolipim（NO-1886）是一種抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）新藥。我們以前的工作發(fā)現(xiàn)Ibrolipim可升高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol-C，HDL-C)的水平，降低血漿TG，升高ABCAl的表達，減輕實驗性動脈粥樣硬化動物模型的主動脈病變程度[2]。另外，我們還利用炎癥因子抗體芯片發(fā)現(xiàn)Ibrolipim能夠顯著降低了脂肪組織24種炎癥因子的表達[3]。這些結(jié)果提示，Ibrolipim抗AS的作用與其減輕機體的過度炎癥反應有關。為此，本研究于2013年9月—2014年3月通過觀察Ibrolipim對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞TNF-α釋放的影響，以進一步探討Ibrolipim抗AS并抑制過度炎癥反應的藥理作用機制。

1 資料與方法

1.1 主要材料

Ibrolipim（NO-1886）化學合成于New Drug Synthesis Section of Otsuka Pharmaceutical factory Inc,Tokushima,Japan.(Lot number: C99L925M)；THP-1細胞購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心；佛波酯購自sigma公司；RPMI1640細胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；TNF-αELISA試劑盒購自abcam公司；ABCA1一抗購自Novus Biologicals公司。

1.2 脂蛋白的分離、氧化修飾及鑒定

自衡陽市中心血站采購健康人血漿。為制備低密度脂蛋白，先用超速離心法，4℃保存部分用CuSO4 10μmol/L氧化修飾成的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）。氧化與否采用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 實驗分組及THP-1源性泡沫細胞模型的制備

用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)靜置培養(yǎng)THP-1細胞。用160 nmol/L PMA孵育THP-1細胞72 h于每次實驗前，誘導其分化成巨噬細胞后，再向RPMI1640培養(yǎng)液（含0.3%BSA）中加入ox-LDL50mg/L，分別靜置培養(yǎng)48 h，誘導其向泡沫細胞分化。將Ibrolipim溶解在二甲基亞礬（dimethylsulfnxidite，DMSO）中，使Ibrolipim和DMSO在細胞培養(yǎng)液中的終濃度分別為3ng/L和0.1%（v/v）。將細胞分為4組：對照組，僅加入含0.1%DMSO細胞的培養(yǎng)液；Ibrolipim處理6 h組；Ibrolipim處理12 h組；I brolipim處理24h組。

1.4 細胞內(nèi)總膽固醇含量測定

采用文獻[4]報道的方法。培養(yǎng)基在處理結(jié)束后棄去，細胞用PBS洗3遍，加入500 μL的0.1 mol/L NaOH，反復凍融3次以裂解細胞，BCA法蛋白定量后，沉淀蛋白用7.2%的三氯乙酸，800×g離心10 min，為進行膽固醇檢測需留上清。繪制標準曲線時以豆甾醇為內(nèi)標，取上清液100 μL，加入200μL 8.9 mol/L氫氧化鉀溶液，膽固醇酯水解后為細胞內(nèi)總膽固醇樣品，加入200 μL 1 mol/L氫氧化鈉為游離膽固醇樣品。內(nèi)標液分別與各樣品混勻，抽提用正己烷和無水乙醇，然后真空干燥，并用1.5 mol/L三氧化鉻進行氧化衍

生，樣品溶解采用100μL乙晴-異丙醇（80∶20），上樣于高效液相色譜儀。檢測采用柱溫4℃的C-18柱，1 mL/min流速，250nm紫外光進行，以峰面積定量膽固醇，內(nèi)標校準，細胞蛋白單位為mg/g。

1.5 腫瘤壞死因子-α的檢測

采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞TNF-α的釋放水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.6 免疫印跡法檢測三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al的表達

經(jīng)預冷的PBS將收集的各時間點細胞洗滌3次，加入細胞裂解液裂解細胞，置于冰上20min后，于10000r/min，4℃，離心10min，小心吸出上清液，蛋白質(zhì)定量用BCA法進行，每條泳道取蛋白質(zhì)50 μg/泳道加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸使蛋白質(zhì)變性。120 V分離膠，80 V積層膠，蛋白質(zhì)用電泳分離，35 mA 16 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉2 h2%BSA室溫，ABCA1一抗加入，4℃16 h。洗膜TBST 15 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h。洗膜TBST 15 min后，底片顯影采用免疫印跡熒光檢測試劑盒進行。掃描膠片，以實驗組與對照組的面積灰度值為100%進行比較和半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析和處理，采用(x±s)表示實驗所得計量數(shù)據(jù)，組間采用方差分析，P<0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 Ibrolipim對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇含量的影響

結(jié)果如表1所示。與對照組比較，THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞經(jīng)Ibrolipim處理不同時間（6 h、12 h和24 h）后發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)游離膽固醇含量和總膽固醇含量不斷減少。細胞內(nèi)總膽固醇含量12 h時即出現(xiàn)明顯下降，從對照組的（399±34）mg/g下降至（294± 39）mg/g，與對照組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；細胞內(nèi)游離膽固醇含量12 h時也出現(xiàn)明顯下降，從對照組的（165±30）mg/g下降至（122±18）mg/g，與對照組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；24 h時細胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇含量進一步下降，與對照組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 Ibrolipim降低THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇含量

2.2 Ibrolipim對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞腫瘤壞死因子-α釋放的影響

結(jié)果如圖1所示。細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量經(jīng)ELISA法檢測后發(fā)現(xiàn)，TNF-α的水平逐漸降低。24 h和12 h的TNF-α水平分別為（1165±117）ng/L和（1579±106）ng/L，與對照組的TNF-α水平（1857±126 ng/L）比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 Ibrolipim抑制THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞TNF-α的釋放

2.3 Ibrolipim對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al的表達的影響

Ibrolipim對ABCA1表達的影響如圖2所示。隨著Ibrolipim處理時間的延長，ABCA1的表達逐漸升高。6、12、24 h組ABCA1蛋白的表達分別較對照組增加了45.5%、90.9%、159.1%，12h組和24 h組與對照組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 Ibrolipim升高THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1的表達

表2 Ibrolipim升高THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1的表達

3 討論

大量證據(jù)表明AS本質(zhì)上是一種慢性炎癥性疾病。脂質(zhì)條紋的形成是AS的早期病變，其主要病理形態(tài)學改變是動脈內(nèi)膜下有大量胞質(zhì)中含有脂蛋白的泡沫細胞聚集。血液循環(huán)當中的單核細胞在動脈內(nèi)膜易損部位與內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附啟動了脂質(zhì)條紋的形成。黏附的單核細胞在趨化分子的作用下向動脈內(nèi)膜下遷移，并分化成巨噬細胞。巨噬細胞雖具有吞噬病原體、激活白細胞，釋放多種酶和生物活性介質(zhì)，發(fā)揮抵御感染和保護機體的作用，但是巨噬細胞還具有攝取脂蛋白的功能。過多的脂質(zhì)在細胞內(nèi)聚積，巨噬細胞可轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。泡沫細胞的形成是AS的

關鍵環(huán)節(jié)之一。因此，抑制巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和炎癥反應成為AS預防和治療的一個方向。研究表明，巨噬細胞在攝取大量ox-LDL之后TNF-α的釋放增加[5]。TNF-α可刺激內(nèi)皮細胞表達黏附分子，如血管細胞粘附分子、細胞間粘附分子和E-選擇素。這些黏附分子將循環(huán)中的單核細胞結(jié)合至內(nèi)皮細胞，再通過單核細胞趨化蛋白-1的作用進入動脈壁，如此反復循環(huán)，使泡沫細胞的形成越來越多。因此，減少巨噬細胞TNF-α的釋放可以延緩動脈粥樣斑塊的形成、抑制AS的發(fā)展[6-7]。

合成化合物Ibrolipim是一種抗AS新藥。我們已完成的研究發(fā)現(xiàn)，用Ibrolipim治療高膽固醇喂養(yǎng)的新西蘭兔，可提高血漿脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）活性30%～40%，升高HDL-C，而甘油三酯（triglyceride，TG）減至正常水平，有效地減少動脈粥樣硬化性斑塊面積。用Ibrolipim治療高糖高脂飲食誘發(fā)糖尿病的新西蘭兔和貴州小香豬，發(fā)現(xiàn)NO-1886降低血漿游離脂肪酸、TNF-α、，升高HDL-C，促進脂肪組織過氧化物酶體增殖激活核受體γ、LPL mRNA表達，抑制TNF-α表達，抑制主動脈AS病變。另外，Ibrolipim通過肝X受體-α信號途徑上調(diào)C型尼曼-匹克蛋白1（Niemann-Pick C1 Protein，NPC1）的表達，促進THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇的流出。盡管如此，對于Ibrolipim抗AS的分子機制，尤其是對巨噬細胞炎癥因子釋放的作用我們還所知甚少。

在本研究中我們用Ibrolipim處理泡沫細胞12 h、24 h后，細胞培養(yǎng)液中TNF-α的水平分別降低了15.0%、37.3%。由于TNF-α不僅能夠直接促進泡沫細胞的過度炎癥反應，還能抑制膽固醇流出蛋白ABCA1的表達，那么降低TNF-α的水平是否會消除TNF-α對ABCA1的抑制作用呢？為此，我們采用western blot方法檢測了ABCA1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用Ibrolipim處理泡沫細胞6h、12h、24h后，ABCA1蛋白的表達分別較對照組增加了45.5%、90.9%、159.1%，細胞內(nèi)總膽固醇含量和游離膽固醇含量不斷減少，這些結(jié)果都說明TNF-α水平降低能夠減輕對ABCA1表達的抑制。因此，我們認為Ibrolipim抗AS的藥理機制與其減少泡沫細胞TNF-α的釋放有關，但確切機制還有待進一步深入研究。

[1]Zhang Y,Yang X,Bian F,et al.TNF-α promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells[J].crosstalk between NF-κB and PPAR-γ.J Mol Cell Cardiol，2014（72）:85-94.

[2]Chi Zhang,Weidong Yin,Duanfang Liao,et al.NO-1886 upregulates ATPbindingcassettetransporterA1andinhibitsdiet-induced atherosclerosis in Chinese Bama minipigs[J].Journal of Lipid Research，2006（47）:2055-2063.

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R972.6

A

1672-5654（2014）10（b）-0145-03

2014-07-06）

尹衛(wèi)東（1957-），男，湖南衡陽人，博士，教授，研究方向：糖尿病發(fā)病機制。

黃靚（1979-），女，湖南郴州人，碩士，講師，研究方向：脂代謝與動脈硬化。