韋毅支 成斌 孫桂蘭 匡中國

貴州省興義市人民醫(yī)院感染性疾病科，貴州興義562400

PCR（FQ-PCR）檢查在肺結(jié)核診斷中的臨床價(jià)值

韋毅支 成斌 孫桂蘭 匡中國

貴州省興義市人民醫(yī)院感染性疾病科，貴州興義562400

目的了解實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光定量PCR（FQ-PCR）監(jiān)測在肺結(jié)核診斷中的臨床價(jià)值。方法采用前瞻性的方法用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)對繼發(fā)性肺結(jié)核患者的痰和結(jié)核性胸膜炎患者的胸水作DNA(TB-DNA)定量監(jiān)測，同時(shí)對非肺結(jié)核患者的痰作DNA(TB-DNA)定量監(jiān)測。結(jié)果繼發(fā)型肺結(jié)核147例，痰涂片陽性率為21.09%，痰TB-DNA陽性例次率為36.73%；痰涂片抗酸染色陽性例次率為15.04%；在痰涂片TB陽性34例次中，痰菌TB-DNA陽性例次率為23.53%。在痰涂TB陰性的192例次中，TB-DNA陽性例次率為39.06%。結(jié)核性膜炎胸水檢查TB-DNA108例次，陽性例次率為12.03%；非肺結(jié)核患者112例。假陰性率為70.21%，假陽性率為9.60%，靈敏度為29.8%，特異度為90.3%。結(jié)論熒光定量PCR(FQ-PCR)TBDNA監(jiān)測結(jié)果與國內(nèi)報(bào)到不一致，其假陰性高，假陽性亦高，靈敏度低，特異度亦不高，且痰涂片抗酸桿菌陽性病人的痰TB-DNA陽性例次率亦低，對臨床診斷幫助不大，不作為疑似肺結(jié)核病人的常規(guī)檢查。

時(shí)動(dòng)態(tài)熒光定量；肺結(jié)核；靈敏度；特異度

肺結(jié)核發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，由于抗菌藥物的不合理使用及不規(guī)則治療，使結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥菌株而致多重耐藥或耐多藥結(jié)核菌產(chǎn)生，給臨床治愈肺結(jié)核帶來了極大困難。痰涂片抗酸染色查到結(jié)核抗酸桿菌和痰結(jié)核菌培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌是臨床確診肺結(jié)核并與其他肺部疾病鑒別的重要依據(jù)。近年來作為直接檢測分支桿菌、種系鑒定和藥敏試驗(yàn)的許多分子學(xué)方法得到了長足發(fā)展，大大提高了結(jié)核的檢出率，其中，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光定量PCR（FQPCR）因其技術(shù)成熟具有較高的靈敏度和特異性，已逐漸應(yīng)用于臨床，為了解其在肺結(jié)核診斷中的臨床價(jià)值，對2012年3月—2013年12月之間在我院住院的肺結(jié)核病人和非肺結(jié)核病人進(jìn)行痰或胸水PCR（FQ-PCR）檢測TB-DNA結(jié)果與傳統(tǒng)的痰涂片或胸水涂片查抗酸桿菌的方法進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用前瞻性的方法用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)檢測肺結(jié)核患者238例，其中男性155例，女性83例，年齡10～82歲，診斷為繼發(fā)型肺結(jié)核147例，結(jié)核性胸膜炎91例。送檢痰標(biāo)本147例，胸水91例。非肺結(jié)核患者112例。痰標(biāo)本作結(jié)核分枝桿菌DNA (TB-DNA)定量，同時(shí)進(jìn)行痰抗酸染色檢查；胸水作結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)定量，同時(shí)進(jìn)行胸水抗酸染色檢查。對非肺結(jié)核患者的痰液作結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)定量作對照，以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),分別計(jì)算TB-DNA、抗酸染色檢查的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，對兩組結(jié)果進(jìn)行比較，以了解其在臨床診斷中的價(jià)值。

1.2 材料與試劑

檢測儀器為廣州達(dá)安DA-7600型檢測系統(tǒng)。試劑亦為廣州達(dá)安生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢驗(yàn)試劑盒（PCR—熒光法）。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提?。?）陰性質(zhì)控品處理。提取陰性質(zhì)控品，8，000rpm離心數(shù)秒，吸50～0.5mL滅菌離心管中，加入50uL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理（10±1）min；12，000rpm離心5 min，備用。

（2）痰或胸水處理。①向玻璃管中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置15～30 min待液化；②取液化后標(biāo)本1.0～1.5 mL離心管，12，000rpm離心5 min；③去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 mL混勻，12，000 min離心5 min，如此兩次。去上清，沉淀加入50 uL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理（10±1）min；12，000rpm離心5 min，備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增PE GeneAmp5700操作。

（1）試劑準(zhǔn)備：按比例（TB—PCR反應(yīng)液40 uL/人份+Taq酶/人份）取相應(yīng)的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43 uL/管分裝至0.2mL離心管中，備用。

（2）加樣：向準(zhǔn)備好試劑的0.2 mL離心管中，分別加入處理后的樣品（包括標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品）上清液2 uL，或直接加入陽性定量參考品2 uL，8，000rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。

（3）編輯。①按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性定量參考品以及未知標(biāo)本（含臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品），并在name欄中設(shè)置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，點(diǎn)擊工具欄中P鍵，選擇Prl Primerl后關(guān)閉窗口。②打開instrument窗口設(shè)置循環(huán)條件：93℃2 min，然后按93℃45s→55℃60s→10個(gè)循環(huán)，再93℃30s→55℃45s→30個(gè)循環(huán)。保存文件，運(yùn)行。

（4）結(jié)果分析。①反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。②分析條件設(shè)置：根據(jù)分析圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Valve值。使Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳，即correlation數(shù)值介于-1.0～-0.97。在Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。③到Tray窗口記錄未知標(biāo)本數(shù)值（C）。“C”表示樣品的濃度和含量。

1.3.3 質(zhì)量控制陰性質(zhì)控品：增長的曲線不呈S型曲線或Ct值= 30；陽性質(zhì)控品：增長曲線呈S型曲線，且強(qiáng)陽性質(zhì)控品定量參考值在1×106基因拷貝/mL～2.0×107基因拷貝/mL范圍，臨界陽性質(zhì)控品定量參考值在2×102基因拷貝/mL～2.0×104基因拷貝/mL范圍；以上要示需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無效，需從新進(jìn)行。

表1 238例肺結(jié)核痰及胸水兩種方法檢測結(jié)果

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示。

2 結(jié)果

繼發(fā)型肺結(jié)核147例，31例痰涂片抗酸染色找結(jié)核分枝桿菌陽性。痰涂片陽性率為21.09%，繼發(fā)型肺結(jié)核痰TB-DNA檢查例次226例次，TB-DNA陽性83例次，陽性例次率為36.73%；痰涂片TB陽性34例次，痰涂片抗酸染色陽性例次率為15.04%；在痰涂片TB陽性34例次中TB-DNA檢查陽性例次為8例次，痰菌陽性TB-DNA陽性例次率為23.53%。在痰涂TB陰性的192例次中，TB-DNA陽性例次為75例次，TB-DNA陽性例次率為39.06%。結(jié)核性膜炎胸水檢查TB-DNA108例次，陽性13例次，陰性95例次，陽性例次率為12.03%。非肺結(jié)核患者112例，查痰TB-DNA 124例次，TB-DNA陽性12例次，假陰性率為70.21%，假陽性率為9.60%。靈敏度為29.8%，特異度為90.3%。具體見表1和表2。

表2 FQ-PCR TB DNA檢測結(jié)果

3 討論

痰涂片抗酸染色查到結(jié)核抗酸桿菌和痰結(jié)核菌培養(yǎng)出結(jié)核抗酸桿菌仍是確診肺結(jié)核的重要依據(jù)，痰涂片抗酸染色法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，但敏感性差，不能將結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌區(qū)別開來，其診斷的特異性低。隨著分子生學(xué)的快速發(fā)展，熒光PCR（FQ-PCR）技術(shù)把核酸擴(kuò)增、雜交和光譜技術(shù)結(jié)合在一起，在封閉狀態(tài)下檢測，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而出現(xiàn)假陽性，利用特異性探針，實(shí)時(shí)檢測，與自動(dòng)分析一體化，實(shí)現(xiàn)了精確、特異、簡便、快速的檢測。我院肺結(jié)核147例肺結(jié)核痰涂片陽性檢出率為21.09%，痰菌熒光定量PCR法的陽性檢出例次率為36.73%，痰菌熒光定量PCR法的陽性檢出例次率明顯高于痰涂片抗酸染色陽性例次率（抗酸染色陽性例次率為15.04%），肺結(jié)核痰涂片陽性檢出率與國內(nèi)痰涂片21.0%報(bào)道值相近，但本研究的PCR法檢測陽性率低于國內(nèi)64.0%～90%的報(bào)道的報(bào)道[1-3]。

我院結(jié)核性胸膜炎胸水熒光定量PCR法的陽性檢出例次率為12.03%。明顯低于應(yīng)用PCR技術(shù)檢測胸水中的TB-DNA，敏感性為38.5%的報(bào)道，主要是出現(xiàn)假陰性所致，出現(xiàn)假陰性的原因是DNA聚合酶活力不夠，或因有酚、氯仿等物存在而使其活性受到抑制等因素影響PCR循環(huán)擴(kuò)增效率，減少特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)量。有學(xué)者報(bào)道約5%的標(biāo)本組中測到抑制物的存在，據(jù)認(rèn)為是DNA聚合酶的抵制物[4]。

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染而引起的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病，根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全世界共有2000萬肺結(jié)核病人，其中95%在發(fā)展中國家，而我國排列世界第二，僅活動(dòng)性肺結(jié)核病人就有近500萬。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)因其快速簡便，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要輔助手段[5]。本研究肺結(jié)核患者痰菌陽性病人TB-DNA陽性例次率為23.53%。非肺結(jié)核患者出現(xiàn)6例痰熒光定量PCR法TB-DNA出現(xiàn)假陽性，假陽性例次率為9.60%，分析其原因考慮為在標(biāo)本預(yù)處理和DNA純化過程操作不當(dāng)造成的標(biāo)本污染所致的假陽性[6]。我院肺結(jié)核患者TB-DNA假陰性率為70.21%，靈敏度為29.8%，特異度為90.3%，故假陰性高，假陽性亦高，靈敏度低，特異度亦不高，且痰涂片抗酸桿菌陽性病人的痰TB-DNA陽性例次率僅為23.53%，故痰或胸水TB-DNA檢驗(yàn)結(jié)果陽性不能肯定肺結(jié)核，陰性亦不能排除肺結(jié)核，雖痰TB-DNA陽性率高于痰涂片陽性率，但臨床診斷價(jià)值不大，故痰或胸水熒光定量PCR法查TB-DNA不作為疑似肺結(jié)核病人的常規(guī)檢查。

[參與文獻(xiàn)]

[1]吳國蘭，陳曉紅，李學(xué)玲，等，4種不同支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測方法在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究[J].中國臨床醫(yī)生，2013，41（3）39-41.

[2]牛海軍，張信鴿，趙長生，等.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值[J].ATD醫(yī)藥論壇雜志，2013，34（9）：132-133.

[3]孫集思，陳亦洋.PCR法檢測痰液結(jié)核桿菌對診斷價(jià)值的研究[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2012，14（2）：266.

[4]徐偉，張小潤，高林虎.PCR診斷結(jié)核性炎的臨床評價(jià)[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2010，13（7）：1045-1046.

[5]牛海軍，張信鴿，趙長生，等.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值[J].醫(yī)藥論壇雜志，2013，34（9）：132-133.

[6]李銳成，劉昕陽，鄒菊賢，等，3860例不同標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌DNA檢測結(jié)果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（8）：1987-1989.

R521

A

1672-5654（2014）10（a）-0156-02

2014-08-05）

韋毅（1973-），男，漢族，貴州省興義市人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事傳染病診療工作。